伴侶動物沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性試驗

李玉蘭

（青海省海北州剛察縣沙柳河鎮獸醫站，海北 812300）

伴侶動物沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性試驗

李玉蘭

（青海省海北州剛察縣沙柳河鎮獸醫站，海北 812300）

沙門氏菌是革蘭氏陰性、細胞內寄生的人畜共患的腸道致病菌。迄今為止，世界已發現2 523個血清型。其中，我國發現的有216種。本菌一年四季均可引發疾病，一般呈現散發或地方流行。多種因素可促使本病的發生，如環境污染、畜舍擁擠，分娩、手術和新引進家畜未實行隔離檢疫等都可能造成該病的流行。East Anglia 大學的研究表明：沙門氏菌感染的發生不僅存在商店或廚房，而且在飼養場和飼料中也是重要來源。

目前，依然采取常規分離鑒定技術分離沙門氏菌。國內外學者相繼建立了諸如免疫磁性分離技術、免疫熒光標記、“四管法”檢測技術、生物素標記DNA 探針、菌落雜交檢測技術、核酸檢測技術、SPA-協同凝集試驗、PCR 檢測技術及常規ELISA 法和雙抗夾心ELISA法等。自1992年Rahn等首次設計出針對沙門氏菌的特異性引物用于沙門氏菌PCR檢測以來，國內外的許多學者陸續進行了利用PCR技術檢測沙門氏菌的研究，并研制成適合臨床應用的檢測試劑盒，通過對糞便、水、飼料、畜產品等樣品的沙門氏菌檢測，為沙門氏菌的檢測又提供了一種快速、敏感、特異的檢測方法。這些方法雖然敏感性高和特異性好，但檢測成本高，易出現假陽性，且需要的儀器昂貴，不適宜基層應用。本試驗選擇國標法GB 47894-2010對伴侶動物源沙門氏菌進行分離鑒定及耐藥性試驗，現將試驗結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 隨機無菌采取西寧市部分寵物醫院（和諧、加旺、百斯特）各種犬貓鼻腔分泌物棉簽及直腸深部棉簽，分別剪去末端投入滅菌小試管中并編號，置4℃冰箱備用。

1.1.2 培養基及試劑 SS培養基、麥康凱培養基、營養肉湯、普通瓊脂斜面、0.85%生理鹽水、靛基質培養基均由青海大學農牧學院傳染病實驗室制備。葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、水楊苷、MR、V-P、明膠、硫化氫、西蒙氏枸櫞酸鹽、硝酸鹽、半固體和尿素酶等生化培養基均購于北京陸橋技術有限責任公司（批號：080606）。

1.1.3 分型血清 沙門氏菌屬診斷血清（衛生部蘭州生物制品研究院所生產，批號810003）。

1.1.4 藥敏紙片 氟啶酸（ENX）、呋喃妥因（FT）、頭孢吡肟（FEP）、?？虅冢–EC）、丙氟哌酸（CF）、阿莫西林（AMX）、克林霉素（CM）、強力霉素（DX）、羅美沙星（LMF）、利福平（RA）、磺胺異噁唑（SLZ）、氟羅沙星（FO）、萬古霉素（VA）、氯霉素（C）、磷霉素（FOS）、乙基西梭霉素（Netromycin）、復方新諾明（SXT）、左氧氟沙星（LVF）、美洛西林（MEZ）、奧復星（OF）、鏈霉素（S300）、青霉素（P）、先鋒霉素VI（CH）、頭孢哌酮（CFP）、卡那霉素（K）、氨卡西林（AMP）、頭孢呋辛（XM）、頭孢噻肟（CTX）、妥布霉素（TM）、羧芐青霉素（AMP）、頭孢美唑（CMZ）、四環素（TE）、哌拉西林（PIP）、復達欣（CAZ）、丁胺卡那霉素（AN）、紅霉素（E）、先鋒霉素V（CFZ）、頭孢曲松（CRO）、慶大霉素（GM10）、阿奇霉素（AZI）40種藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司。

1.1.5 主要試驗儀器 游標卡尺（0～150 mm，上海量具刃具廠）；微量移液器（上?？迫A實驗系統有限公司）；SHZ-82回旋式氣浴恒溫振蕩器（金壇市科析儀器有限公司）；AB204-E，METTLER TOLEDO電子天平（瑞士產）；琴島-得貝FF40冰箱（中國青島冰柜廠生產）；YXQ-SG46-280手提式軋電兩用高壓蒸汽滅菌器（丹東市日用五金廠生產）；0704224單筒光學顯微鏡（中國重慶奧特光學儀器有限公司）；KMC-1300V 渦旋混合器（上海市躍進醫療器械一廠）；HH-B11-600電熱恒溫培養箱（天津市實驗儀器廠）等。

1.1.6 試驗動物 健康昆明系小白鼠18只（雌雄不分），12～16 g/只（均購于青海省地方病研究所）。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 用微量移液器分別無菌吸取0.85%滅菌生理鹽水各2 ml依次加入滅菌的小試管中，并相應編號，并在渦旋混合器上震蕩，每支試管震蕩15 min/次，連續3次。

1.2.2 樣品增菌 分別用微量移液器吸取上述處理好的混懸液1 ml各加入到相應的滅菌營養肉湯中，37℃回旋式氣浴恒溫振蕩器培養16～18 h。

1.2.3 目的菌的分離 分別無菌勾取上述肉湯培養物2～3接劃線種環于SS培養基平板上，37℃溫箱培養18～24后觀察菌落形態。

1.2.4 目的菌的純化 挑選SS平板上可疑菌落并進行涂片，革蘭氏染色鏡檢，同時進行數次純化培養，并將純化好的疑似沙門氏菌分別劃線接種于普通瓊脂斜面，37℃溫箱培養18～24 h后置4℃冰箱備用。

1.2.5 生化鑒定 將上述純化好的疑似沙門氏菌菌株分別無菌接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、水楊苷、MR、V-P、明膠、硫化氫、西蒙氏枸櫞酸鹽、硝酸鹽、半固體、尿素酶、靛基質等生化培養基中，37℃溫箱培養24～48 h，觀察結果。

1.2.6 血清學分型 操作方法依據163種沙門氏菌屬診斷血清使用說明書進行。

1.2.7 藥敏試驗 隨機選取將上述純化好的2株沙門氏菌菌株分別劃線接種到普通瓊脂斜面上，37℃溫箱培養18～24 h后，再用0.85%滅菌生理鹽水無菌洗滌，并且用麥氏比濁管比濁，選取9×108活菌/ml濃度的菌懸液，用滅菌棉簽蘸取菌液并在管內壁上擠去多余的菌液，均勻涂布MH（A）培養基表面（培養基厚度約為4 mm），每次涂布完1/3平板時將平板旋轉60°直至涂滿整個平板，連續涂布3次，保證涂均勻。再分別依次貼上上述40種藥敏紙片，每塊平板貼3片，37℃培養18～24 h判定結果。判定標準參照美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）藥敏紙片擴散法法規。

1.2.8 致病性試驗 隨機選取上述進行藥敏試驗用的1株沙門氏菌菌懸液（9×108活菌/ml）腹腔注射小白鼠1只，0.5ml/只；同時用0.85%滅菌生理鹽水注射小白鼠1只作對照，0.5ml/只。

2 結果

2.1 目的菌的培養特性及菌落形態觀察

在SS培養基上生長呈現出圓形、隆起、邊緣整齊、灰白色的菌落，大部分菌落中心變黑，邊緣灰白色；在麥康凱瓊脂平板上形成圓形、隆起、邊緣整齊、灰白的菌落；在營養肉湯中生長較好，呈現均勻渾濁。經革蘭氏染色鏡檢，鏡下見革蘭氏陰性，無芽孢的小桿菌。

2.2 生化鑒定

常規分離培養鑒定技術檢出樣品中沙門氏菌23株，陽性率為18.8%（23/122）。其中Q1是4#、9#、5-1、7#；Q2是8#、3-2、12#、10#、8-2；Q3是3-1、6#、2-2、1#、7-1、4-2；Q4是23-2、11#、5#、2#；Q4是3#、9-2、14-2、6-2。

表1 23株沙門氏菌的生化反應結果

2.3 血清學分型

通過血清學分型共檢出鼠傷寒沙門氏菌7株，占整個分離株的30.44%（7/23）；丙型副傷寒沙門氏菌4株占整個分離率的17.40%（4/23）；基爾瓦沙門氏菌Ⅱ2株占整個分離率的8.70%（2/23）；傷寒沙門氏菌4株，占整個分離率的17.40%（4/23）；阿邦尼沙門氏菌、徹斯特沙門氏菌和魯齊齊沙門氏菌各1株，占整個分離率的4.35%（1/23）；甲型沙門氏菌3株，占整個分離率的13.04%（3/23）。結果詳見表2。

表2 沙門氏菌血清學鑒定結果

2.4 藥敏試驗

用游標卡尺測量抑菌圈直徑的大小，測量3次，即最長值、最短值、中間值，最后求3次測量值的平均值。試驗結果見表3、表4。

表3 沙門氏菌耐藥性檢測結果

表4 2株沙門氏菌敏感、中介、耐藥數統計（單位：種）

2.5 致病性試驗

試驗組小白鼠于24 h內死亡，證明分離菌對小白鼠有一定的致死作用。對照組小白鼠飼喂1周后仍健活。無菌采取肝、脾等臟器觸片，革蘭氏染色，鏡檢見到與上述形態、染色一致的病原菌，并從死鼠肝、脾中分離出該病原菌，再將這2株分離菌進行生化鑒定。結果顯示，從死亡小鼠體內和從樣品中分離的病原菌生化結果完全一致。

3 討論

3.1 沙門氏菌分離情況

本次分離到沙門氏菌菌株23株，陽性率為18.8%（23/122）。經血清學鑒定，23株沙門氏菌中鼠傷寒沙門氏菌占7株；甲型副傷寒沙門氏菌3株；丙型副傷寒沙門氏菌4株；阿邦尼沙門氏菌、徹斯特沙門氏菌和魯齊齊沙門氏菌各1株；傷寒沙門氏菌4株；基爾瓦沙門氏菌Ⅵ2株。由此可見鼠傷寒沙門氏菌為其中的優勢菌株，占整個分離株的30.44%（7/23）；而阿邦尼沙門氏菌、徹斯特沙門氏菌和魯齊齊沙門氏菌各1株，占整個分離株的4.35%（1/23）。

3.2 血清型不同，致病情不同，癥狀不同

該菌有兩種適應的宿主血清型，對不同的畜禽其致病性不一樣的。主要感染的動物有豬、牛、羊、馬、駱駝、兔、毛皮動物及禽等。在各種動物上能引起發病的血清型不同，共同癥狀是食欲下降、下痢，有的還能造成流產等 。

3.3 人獸共患

近幾年來，醫院內嬰幼兒和動物感染沙門氏菌都十分嚴重，并有逐步成上升的趨勢，沙門氏菌一旦感染人就會造成人的胃腸炎急病和食物中毒。臨床表現主要是惡心、嘔吐、腹瀉、頭暈、發燒、四肢無力等癥狀。人感染沙門氏菌主要是與食用了被沙門氏菌污染的食物有關。

3.4 抗生素治療

耐藥性問題已成為全世界關注的焦點，由于濫用抗生素，沙門氏菌的抗菌譜越來越廣，強度也越來越大。為此，我們從分離的23株沙門氏菌中隨機選取了2株沙門氏菌分離株進行了耐藥性監測。結果顯示，4#菌株對于VA、FT、SXT、E、TE、CM、P、AZI、S300和FO等15種藥物有耐藥性，耐藥率37.5%（15/40）；23-2#菌株對于FT、VA、E、TE、C、S300、FO和AZI等13種藥物有耐藥性，耐藥率為32.5%（13/40）。

3.5 預防

由于伴侶動物與人接觸密切，尤其是少年兒童對于伴侶動物尤為偏愛。所以對于經常接觸寵物且沒防范措施的兒童來說，極易感染沙門氏菌。在本次藥敏監測中，4#菌株對TM、PIP、AMP、FEP、LVF、FOS、MEZ、XM、CFZ、ENX和AMP等20種藥物敏感，敏感率50.00%（20/40）；對CAZ、Netromycin、CEC、AMX和CF等5種藥物中介，中介率12.5%（5/40）。23-2#菌株對SXT、PIP、AMP、FEP、CAZ、CAZ、CRO、MEZ、SLZ、XM、CFZ和AMP等20種藥物敏感，敏感率50.00%（20/40）；對TM、LVF、Netromycin、FO、AMX、CF和ENX等7種藥物中介，中介率17.5%（7/40）。其中，頭孢類的藥物尤為顯著，因此，一旦沙門氏菌在伴侶動物之間傳播或與人交叉感染時，應進行藥物的篩選，選取2～3種敏感或中介藥物進行交替治療，避免耐藥菌株的產生。

3.6 分離率

本次分離到沙門氏菌菌株23株，陽性率為18.8%（23/122）。與在本實驗室中所做的其他樣品（動物性飼料、香腸、火腿腸、豬胴體、牛羊胴體、鯽魚鰓、仔蝦、雞蛋）中沙門氏菌帶菌情況進行比較。結果發現，分離率有著明顯的不同。此次的分離率比以前的要明顯偏低。分析原因，可能與樣品的不同有關。

[1] Popoff M Y，Bockemuhl J，Brenner F W.Supplement 2001（no.44）to the Kauffmann-White scheme.[J].Res Microbiol，2001，152（10）：907～909.

[2] Collette F.Rachel S，Linda L G，et al.Molecular analysis of the rfb Oantigen gene cluster of Salmonella enterica serogroup 0：6，14 and de-velopment of a serogroup-specific PCR assay [J].Applied and Envirom-mental Microbiology，2003，69（10）：6099～6105.

[3] 蔡寶祥等主編.實用家畜傳染病學[M].（第四版）上海：上?？萍汲霭嫔?，2001.

[4] 魚艷榮，李健強.有機酸用于沙門氏菌的控制[J].動物醫學進展，1998，19（1）：41.

[5] 韓志輝，石全友，冶文先，等.葡萄球菌蛋白-協同凝集試驗檢測種蛋沙門氏菌[J].中國獸醫技，1996，26（6）：29～31.

[6] 張艷紅，吳延功，杜元釗，等.沙門氏菌快速檢測方法研究進展[J].動物醫學進展，2001，22（2）：39～41.

[7] 劉華偉，郭藹光，馬立農，等.PCR技術在沙門氏菌快速檢測中的應用[J].動物醫學進展，2004，25（6）：55～58.