反復凍融法輔助提取油菜花粉多糖的研究

郭衛蕓，劉海英，白玉敏，楊公明

（1.許昌學院食品科學與工程學院，河南許昌 461000；2.西華大學生物工程學院，四川成都 610039；3.華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642）

反復凍融法輔助提取油菜花粉多糖的研究

郭衛蕓1，劉海英1，白玉敏2，楊公明3，*

（1.許昌學院食品科學與工程學院，河南許昌 461000；2.西華大學生物工程學院，四川成都 610039；3.華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642）

摘 要：通過對加水量、凍結時間、解凍溫度、凍融次數等進行單因素試驗及正交試驗，驗證反復凍融法對油菜花粉中多糖的輔助提取效果，確定最佳處理條件為：加水量40 mL/100 g，凍結時間4 h，解凍溫度80℃，凍融次數2次，在此條件下，油菜花粉可溶性多糖溶出率可達到21.79%。

關鍵詞：油菜花粉；多糖；反復凍融；提取

油菜為十字花科蕓苔屬中用于采籽榨油的植物，其花粉呈黃色，多數為近球形或長球形，表面呈顆粒狀，形體大且外壁薄、清香、無怪味[1]?；ǚ蹱I養豐富，碳水化合物占40%～50%，其中絕大多數是多糖，長期合理食用花粉，可明顯增強體質、提高免疫力、延緩衰老[2]。我國是世界養蜂大國，蜂花粉年產量約1 500 t，居世界首位，但花粉資源利用率卻很低，開發花粉食品具有廣闊的市場前景和巨大的潛在價值[3]。由于花粉壁結構復雜，組織致密，對花粉營養物質的溶出起到較強的阻礙作用[4-6]。因此，研究合適的破壁工藝，對于提高多糖的得率意義重大。本研究主要驗證反復凍融法對花粉破壁的有效性，并試驗確定合適的處理條件。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

油菜花粉：許昌地區市售；葡萄糖（標準品）；苯酚（分析純）；硫酸（分析純）；95%的乙醇（分析純）；YP2002型電子分析天平、BlueStar型紫外-可見分光光度計：萊伯泰科有限公司；TG16-WS臺式離心機：湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 流程及操作要點

1.2.1.1 流程

油菜花粉→加水溶脹→慢速冷凍→水浴中快速解凍→加水→攪拌→靜置1 h→離心→取上清液→定容[7]→測定多糖

1.2.1.2 操作要點

1）油菜花粉

要求油菜花粉籽粒飽滿，色澤金黃，無蟲蛀，無霉斑，并去除砂粒等雜質。各組取5 g花粉置于準備好的保鮮袋上。

2）加水溶脹

按照各組試驗要求快速準確的加一定量水，用保鮮袋將花粉包住密封，并輕輕揉揉之后室溫下放置30 min，使水分充分滲入到花粉中。

3）反復凍融

按照各組試驗要求在冰箱中緩慢冷凍一定時間后，取出，迅速放在水浴鍋中溶解，如此反復。

4）可溶性糖的溶出

將反復凍融后的花粉全部取出置于離心管中，加水15 mL并將花粉用玻璃棒輕輕搗碎，使溶液充分混合，室溫下放置1 h。

5）離心

以3 000 r/min的速度對上述溶液離心20 min。

6）定容

取離心后的上清液，定容至250 mL。

1.2.2 多糖含量的測定

利用苯酚-硫酸法測定多糖[7-9]。

1.2.2.1 標準曲線的繪制

準確吸取葡萄糖標準溶液（0.1 mg/mL）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分別置于試管中，各加入蒸餾水，使其體積為2.0 mL，再加入6%苯酚1.0 mL，并迅速滴加濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，充分振蕩搖勻之后靜置20.0 min。另外以蒸餾水2.0 mL，加苯酚和濃硫酸，同上述操作做空白對照，于波長490 nm處測吸光度值，得標準曲線，如圖1。

圖1 標準曲線Fig.1 Standard curve

1.2.2.2 可溶性多糖溶出率測定

按1.2.1工藝處理樣品后，將得到的花粉上清液進行100倍稀釋，取稀釋后的樣品2.0 mL，經上述處理后測定吸光值，并計算可溶性多糖溶出率。

式中：A為試樣的吸光度；V為樣液的體積，mL；M為樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 加水量對油菜花粉可溶性多糖的溶出率的影響

共設 5個加水量處理，分別為 10、20、30、40、50 mL/100 g，每個處理重復2次。并在凍結時間3 h、凍結溫度-30℃、解凍溫度80℃、溶解時間20 min及反復凍融3次的條件下凍融，測定可溶性多糖溶出率，結果如圖2。

圖2 加水量對油菜花粉可溶性多糖溶出率的影響Fig.2 Effect of water addition to content of soluble polysaccharides

由圖2可以看出，可溶性多糖的溶出率隨加水量的增加先呈快速上升，后趨于平緩的趨勢。這主要是因為花粉中的水凍結形成冰晶體，加熱融化可以產生張力，從而破壞花粉壁的組織結構，而細胞內外的水分直接關系到冰晶體量的大小。當加水量為30 mL/100 g時可溶性多糖達到20.55%，加水量再繼續增加，可溶性多糖溶出率變化不大，說明在加水量為30 mL/100 g時水分完全填充了細胞內部間隙，導致在凍融過程中冰晶體對細胞的機械作用發揮到最大。

2.2 解凍溫度對油菜花粉可溶性多糖的溶出率的影響

共設5個解凍溫度處理，分別為60、70、80、90、100℃，每個處理重復2次。在加水量為20mL/100 g、凍結時間3 h、凍結溫度-30℃、溶解時間20 min及反復凍融3次的情況下凍融，測定可溶性多糖溶出率，結果如圖3。

由圖3可知，解凍溫度對油菜花粉可溶性糖溶出率影響較顯著。在溫度低于80℃時，可溶性多糖溶出率隨著溫度的升高而升高。當溫度超過了80℃后，可溶性多糖溶出率急劇減少，有人在進行烏龍茶多糖提取研究時也得到了相似的結果[10]。分析認為，溫度過高時，可能會使花粉多糖降解。而溫度太低，細胞破壁率低，多糖溶出不完全?？梢哉J為油菜花粉破壁的解凍溫度在80℃較為合適。

圖3 解凍溫度對油菜花粉可溶性多糖溶出率的影響Fig.3 Effect of defrosted temperature to content of soluble polysaccharides

2.3 凍融次數對油菜花粉多糖溶出率的影響

共設 5個凍融次數處理，分別為 0、2、3、4、5次，每個處理設2個重復。在加水量為20 mL/100 g、凍結時間3 h、凍結溫度-30℃、溶解時間20 min及解凍溫度80℃的條件下進行凍融，測定可溶性多糖溶出率，得結果如圖4。

圖4 凍融次數對油菜花粉可溶性多糖溶出率的影響Fig.4 Effect of repeated freezing and melting times to content of soluble polysaccharides

根據圖4可知，隨著凍融次數的增多，油菜花粉可溶性多糖的溶出率逐漸增大。但開始時油菜花粉可溶性多糖的溶出率增大的幅度較大，在超過3次后，其多糖溶出率增大的幅度較緩慢。分析認為，經過3次凍融，大部分油菜花粉的細胞結構已被破壞。

2.4 凍結時間對油菜花粉多糖溶出率的影響

共設 5 個凍結時間處理，分別為 0、2、3、4、5 h，每個處理設2個重復。在加水量為20 mL/100 g、凍結溫度-30℃、溶解時間20 min、解凍溫度80℃及反復凍融3次、的條件下凍融，測定可溶性多糖溶出率，結果如圖5。

根據圖5可知，在試驗條件下，隨著凍結時間的增多，油菜花粉可溶性多糖的溶出率逐漸增大，當凍結時間超過3 h后，多糖溶出率增大的幅度開始緩慢。分析原因可能是在凍結3 h時，油菜花粉的細胞壁已被破壞，致使大部分可溶性多糖可以突破細胞壁三維網狀結構的束縛而溶出。凍結時間加長，花粉多糖溶出率增加也緩慢。

圖5 凍結時間對油菜花粉可溶性多糖溶出率的影響Fig.5 Effect of freezing time to content of soluble polysaccharides

2.5 正交試驗

為選擇反復凍融法破壁油菜花粉的最佳工藝條件，設計以加水量、解凍溫度、凍融次數、凍結時間為考察因素，以油菜花粉可溶性多糖的溶出率為考查目標的L9（34）正交試驗，因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

經過試驗，結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Result of orthogonal test

由表2可知各因素對油菜花粉可溶性多糖溶出率的影響作用是不同的，4個因素對油菜花粉可溶性多糖溶出率的影響大小順序依次為：B＞C＞A＞D。經過極差分析發現，反復凍融法對油菜花粉破壁的最佳工藝組合為A3B3C1D3，即：加水量40 mL/100 g，凍結時間4 h，解凍溫度80℃，凍融次數2次時，油菜花粉可溶性多糖溶出率較高。在此工藝條件下做驗證試驗，得到3組數據：21.82%、21.75%、21.80%，驗證的平均值為21.79%。

3 結論

1）各因素對油菜花粉可溶性多糖溶出率的影響順序為：凍結時間＞凍融次數＞解凍溫度＞加水量。

2）反復凍融法破壁油菜花粉最佳的工藝組合是：加水量40 mL/100 g，凍結時間4 h，凍融次數2次，解凍溫度80℃，在此條件下，油菜花粉可溶性多糖溶出率可達到21.79%。

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Technics of Extracting Polysaccharides from Rapeseed Pollen with Repeated Freezing and Thawing Method

GUO Wei-yun1，LIU Hai-ying1，BAI Yu-min2，YANG Gong-ming3，*
（1.College of Food Chemistry and Engineering，XuChang University，Xuchang 461000，Henan，China；2.School of Bioengineering ，Xihua Ucniversity，Chengdu 610039，Sichuan，China；3.College of Food Science，South China Agricultual University，Guangzhou 510642，Guangdong，China）

Abstract：Rapeseed pollen was taken as the main raw material and repeated freezing and thawing method was adopted to break the wall of the pollen.The effects on the wall-broken of the rapeseed pollen made by the water content， freeze time， defrosting degree， freezing-thawing times was studied.Through the orthogonal test， the water content was 40 mL/100 g，the freeze time was 4 hours，the defrosting was 80℃，the freezing-thawing was twice.Under the optimal conditions，the dissolving rate of soluble polysaccharide of the rapeseed pollen was 21.79%.

Key words：rapeseed pollen；polysaccharides；repeated freezing and thawing method；extracting

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.007

許昌學院優秀青年骨干教師資助項目；許昌學院科研基金（2013063）

郭衛蕓（1981—），男（漢），講師，碩士，研究方向：農產品貯藏與加工。

2012-10-29