牛乳樣品中布魯氏菌的分離和鑒定

易新萍，馬曉菁，閆晶華，谷文喜，劉麗婭，葉 鋒，吐爾洪·努爾，鐘 旗*

(1.新疆畜牧科學院獸醫研究所，新疆烏魯木齊830000；2.新疆動物衛生監督所，新疆烏魯木齊830017)

布魯氏菌病是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種人畜共患的傳染病，屬于我國規定的二類動物疫病。奶牛是Brucella病最易感的動物之一，主要損害其生殖系統，造成奶牛流產、不孕及乳房炎等癥，并可以經污染的奶制品、流產物等途徑感染人，導致人的波狀熱、關節痛及泌尿生殖系統疾病[1]。因此，奶牛Brucella病嚴重危害奶牛業，并對公共衛生造成嚴重的威脅。

病原分離鑒定是診斷奶牛Brucella病的傳統方法，但以往病原體的分離主要以病料、流產胎兒、流產物等為分菌樣本，該類樣本數少，取樣困難，對操作人員安全危險性大[2]。本研究直接采集奶樣進行細菌分離，并采用PCR結合常規生化實驗鑒定了分離的Brucella，為新疆地區布病的診斷及防治提供了依據。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 采集自3個不同地區奶牛場SAT 檢測為陽性奶牛(抗體效價 1∶200～1∶800)的牛乳樣品25份，-20℃凍存備用；布氏瓊脂培養基(BBLTMBrucella Agar)和TS液體培養基均購自Becton and Dickinson company公司；改良Brucella選擇添加劑(OXOID Ltd)、PCR所用試劑均購自北京莊盟生物有限公司；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；Brucella國際標準菌株牛種544A和羊種16M、國內疫苗株牛種A19、羊種M 5及豬種S2、大腸桿菌DH5α均由新疆畜牧科學院獸醫研究所Brucella病研究室保存。

1.2 細菌培養 將凍融的奶樣混勻，取300μL奶樣接種于含Brucella添加劑的布氏瓊脂培養基上，37℃5%～10%CO2培養，觀察菌落形態。

1.3 布魯氏菌屬的PCR鑒定 挑取培養的疑似Brucella菌落置于含500μL TS液體培養基中，37℃孵育24h后100℃10m in，離心后取上清液作為PCR模板。采用VirB8-PCR方法擴增Brucella的VirB8基因，進行Brucella屬鑒定[3]。

1.4 布魯氏菌種和型的PCR鑒定 參照文獻[4]和[5]AMOS-PCR方法，組合插入序列IS711、牛種(1、2、4、3a 型)、牛種(5、6、9、3b 型)和羊種(1、2、3型)4個引物，優化PCR反應條件：94℃5m in；94℃60s、60℃90s、72℃60s，40個循環；72℃10min。對Brucella分離株進行種型鑒定。

1.5 Bruce lla生物型的生化鑒定 按照布魯氏菌標準鑒定方法進行細菌學鑒定[6]。以Brucella國際標準菌株牛種544A和羊種16M為實驗參考株進行生化鑒定試驗，實驗中CO2需要量、H2S產生、染料抑制(硫堇、復紅)、單項血清凝集(A、M、R)等試驗結果均成立條件下判定分離菌株的生物亞型。

2 結 果

2.1 細菌分離培養 將奶樣接種于含Brucella添加劑的布氏瓊脂培養基，培養至第4d后，25份樣品有9份培養基上生長出0.5mm～2.0mm大小無色、閃光圓形、濕潤、凸起的疑似小菌落(圖1)。

2.2 PCR鑒定 應用VirB8-PCR方法[3-4]對疑似Brucella菌落進行PCR鑒定，以A19疫苗株、羊種M 5株、豬種S2疫苗株和大腸桿菌DH5α分別為陽性對照和陰性對照。VirB8-PCR鑒定結果表明，9個Brucella分離株均擴增出約700bp的特異性片段，與陽性對照一致。陰性對照大腸桿菌DH5α則未見目的片段(圖2)。

2.3 Bruce lla種型PCR鑒定 采用AMOS-PCR方法[4-5,7]對VirB8-PCR陽性Brucella分離株進行種型鑒定，PCR結果表明牛種Brucella(1、2、4、3a型)擴增出約500bp的特異性片段，牛種Brucella(3b、5、6、9型)擴增出約1700bp的目的片段，羊種Brucella(1、2、3型)擴增出750bp的目的片段(圖3)。

2.4 生化鑒定 應用常規生化試驗對PCR鑒定的牛種(3、5、6、9型)Brucella、羊種(1、2、3型)Brucella進行生物型鑒定。經中國疾病與預防控制中心傳染病預防控制所Brucella病組鑒定表明，從2個牛場的牛乳中分離到的7株Brucella為牛種Brucella生物3型，1個牛場中分離的2株Brucella為羊種Brucella生物3型(表1)。

表1 牛乳中分離菌株生化鑒定結果Table 1The results of identification of isolated Brucella strains by biochem ical test in raw milk

3 討論

病原分離鑒定是診斷Brucella病的傳統方法和金標準，但采集病料困難，操作風險大，方法繁瑣、分菌率低。牛乳中含有多種細菌，在細菌的分離過程中，常用的Brucella培養基中添加了改良的Brucella選擇性添加劑，有效地抑制了Brucella以外的各類細菌的生長，能分離到Brucella病原體。本實驗研究表明，對奶牛Brucella病同一感染群，SAT檢測奶牛Brucella病抗體效價為1∶200～1∶400時，奶牛的乳樣分菌率高達50%以上。該方法省時、簡便，取樣容易，一般在3d～5d內就可得到病原體，為奶牛Brucella病的確診提供了切實可行的診斷方法，同時對生牛乳Brucella污染的監測具有重要的食品衛生學意義。

各型Brucella在各種動物間有跨物種間傳播，確認動物感染群及其病原的種型，對確定流行病學狀態、傳染源及采取合適的防控措施有著重要的實用價值[8]。本研究結合PCR技術，快速準確地對新疆地方Brucella分離株進行了種的鑒定。該方法減少了操作者在不可控情況下接觸活菌的機會，極大地降低了Brucella擴散污染的生物安全問題。應用生化試驗確診了新疆地方Brucella分離株的生物亞型為牛種3型和羊種3型。從牛乳中分離到羊種Brucella 3型更進一步表明該地區Brucella羊種3型已成為該病流行的優勢菌種[9]，這將嚴重威脅當地的公共安全。本研究結果為制定新疆地區Brucella病的防控措施提供了重要的參考價值。

[1]吳艷，權亞瑋.奶牛場防控布魯氏菌病存在的問題及凈化措施[J].畜牧與飼料科學，2010，31(5)：120-121.

[2]楊蓮茹，烏倫吉如嘎.奶牛布魯氏茵病病原PCR檢測方法的建立[J].內蒙古農業大學學報，2007，28(2)：1-5.

[3]鐘旗，范偉興，吳冬玲，等.布魯氏菌VirB8-PCR方法的建立[J].中國人獸共患病學報，2008，24(1)：50-54.

[4]鐘旗，易新萍，李博，等.布魯氏菌PCR鑒定方法的研究與應用[J].中國人獸共患病學報，2011，27(3)：241-245.

[5]鐘旗，范偉興.用AMOS-PCR對布魯氏菌種型鑒定的研究[J].中國人獸共患病學報，2007，23(7)：683-686.

[6]聞玉梅主編.現代微生物學[M].上海：上海醫科大學出版社，1999，455-469.

[7]Ocampo-Sosa A A,Balbin J.Development of a new PCR assay to identify Brucella abortus biovars 5,6and 9and the new subgroup 3b of biovar 3[J].Vet M icrobiol,2005,110:41-51.

[8]尚德秋.布魯氏菌病流行病學及分子生物學研究進展[J].中國地方病防治，1996，11(6)：335-348.

[9]王遠志，陳創夫，崔步云，等.羊種布魯氏菌生物3型的分離和鑒定[J].中國人獸共患病學報，2007，29(10)：753-755.