基于納米技術的芯片電泳快速檢測脂蛋白及其亞型的研究

汪 驊，韓崇旭，王惠民，金慶輝，王大新，曹 麗，董蘭梅

(1.蘇北人民醫院臨床醫學檢測中心，江蘇 揚州 225001;2.南通大學附屬醫院檢驗醫學中心，江蘇 南通 226001;3.中國科學院上海微系統與信息技術研究所，上海 205001)

納米技術作為20世紀80年代末誕生的新技術，被公認為目前科學研究和應用的前沿和熱點領域。納米技術開辟了分離科學的一個全新領域，有不少研究成果在《Science》[1-3]和《Nature》[4]等雜志上發表，該項技術得到廣泛的關注。芯片電泳是在玻璃、石英、硅、塑料等基片的微細通道或色譜柱中，以電場為驅動力，借助于離子或分子在電遷移或分配行為上的差異，對復雜試樣中的多種組分進行高速分離分析的技術，使傳統毛細管電泳分離物質的整個過程可以在一塊幾平方厘米的基片上得以實現。研究表明，與在氣相色譜和液相色譜中的應用相比，納米技術顯示出更適合在芯片電泳中發揮作用[5]，其相關研究非?；钴S，應用形式靈活多樣，選擇性和分離效率改善明顯，毛細管電泳和芯片電泳生物分離在此技術推動下進入了一個新的時代。

我們曾利用自制的微芯片結合激光誘導熒光檢測系統快速分離了血清脂蛋白[6]，但脂蛋白各組分間不能有效分離。在前期研究基礎上，我們在芯片電泳緩沖液中加入納米金顆粒作為添加劑，脂蛋白的分辨率顯著提高，在3 min內實現了高密度脂蛋白(HDL)、大而輕低密度脂蛋白(lLDL，即A型LDL)、小而密低密度脂蛋白(sdLDL，即B型LDL)以及極低密度脂蛋白(VLDL)的高效分離。通過對健康人和CHD患者血清脂蛋白分析，探討基于納米技術的芯片電泳的臨床應用價值。

材料和方法

一、芯片及儀器

石英芯片由石英玻璃(DuPont公司)經光刻、濕法腐蝕、低溫鍵合而成[7]，見圖1。芯片分離通道總長76.9 mm(有效長度45 mm)，進樣通道總長28 mm，通道頂寬100 μm，深 25 μm;激光誘導熒光(LIF)分析儀[8]自行研制;OptimaTM L-90K型超速離心機(美國貝克曼公司);CX系統電源(0～5000 V)(中科院上海應用物理研究所)。

二、標準品及緩沖液

HDL、低密度脂蛋白(LDL)、VLDL標準品及納米金(5、10、20 nm，CASno.7440-57-5)、Tricine、十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二醇、甲醇、甲基葡胺均購自美國Sigma公司。硝基苯并噁二唑-C6-?；拾贝?NBD C6-ceramide)購自美國Molecular Probes公司。超速離心制備lLDL(密度為1.020～1.044 kg/L)、sdLDL(密度為1.044 ～1.063 kg/L)[6]。40 mmol/L Tricine 緩沖液(pH 值 9.8)，含40 mmol/L甲基葡胺、0.02 mmol/L十二烷基硫酸鈉、20 nmol/L納米金(5 nm)。所有試劑均為分析純，配制試劑用水為二次蒸餾水。

圖1 微流控芯片

三、臨床資料

CHD患者35例，其中男20例、女15例，年齡56～78歲，均經冠狀動脈造影證實有冠狀動脈病變。正常對照組30名，男15名，女15名，年齡33～70歲，均排除心腦血管疾病。

四、血清樣本的采集及預處理

2 μL 血清加入 4 μL 緩沖液，再加入 2 μL 0.1 g/L NBD C6-ceramide(乙二醇∶甲醇 =9∶1 的混合液預先溶解)進行避光預染，1 min后加入25 μL緩沖液，此為電泳待測樣本。

五、芯片電泳過程

將4 μL檢測樣本加入試樣池，5 μL緩沖液分別加入試樣廢液池、緩沖液池、緩沖液廢液池，各電泳池插入電極。試樣池加+750 V電壓，試樣廢液池接地，緩沖液池加+200 V，緩沖液廢液池加+300V，進樣40 s后同時切換電壓進入分離階段。分離階段緩沖液廢液池加0 V，緩沖液池加+3100 V，試樣池和試樣廢液池均施加+300 V，運行溫度25℃。分離電場強度為403 V/cm。

六、統計學方法

統計方法采用Student's t-test檢驗，數據處理采用SPSS11.5軟件。P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、納米金對脂蛋白分離的影響

芯片電泳分離混合的HDL標準品、VLDL標準品、lLDL和sdLDL，電泳圖譜見圖2。緩沖液中的納米金顆粒為5 nm時，脂蛋白各組分完全分離，當納米金顆粒＞5 nm時，脂蛋白分辨率降低，分離效率下降。圖3為緩沖液中不同濃度的納米金對脂蛋白分離度的影響。當納米金濃度為20 nmol/L時，脂蛋白各組分之間實現基線分離。

圖2 不同大小的納米金顆粒對脂蛋白分離的影響

圖3 緩沖液中不同濃度納米金對脂蛋白分離度的影響

二、芯片電泳與瓊脂糖凝膠電泳分離血清脂蛋白的對比

芯片電泳與瓊脂糖凝膠電泳分離同一健康體檢者血清脂蛋白，結果見圖4。圖4(a)為脂蛋白瓊脂糖電泳圖譜，健康體檢者血清脂蛋白可分出3條區帶，分別為HDL、VLDL及LDL。圖4(b)為脂蛋白芯片電泳圖譜，電泳分離出4條特征峰，分別為lLDL、sdLDL、VLDL及HDL。相對于芯片電泳，瓊脂糖凝膠電泳分析時間長，分辨率不高，不能區分lLDL與sdLDL，而且LDL區帶容易拖尾。

圖4 芯片電泳與瓊脂糖凝膠電泳分離血清脂蛋白的對比

三、線性范圍、檢測限和重現性

在優化的分離條件下，lLDL、sdLDL、VLDL和HDL芯片電泳的線性范圍[信噪比(S/N)=3]分別為0.01 ～0.8、0.04 ～ 1.0、0.04 ～1.0、0.02 ～0.8 mg/L;檢出限分別為 5、5、15 和 8 μg/L。對健康體檢者的血清樣本連續測定5次，lLDL、sdLDL、VLDL和 HDL的峰面積相對標準偏差(RSD)分別為 3.5%、2.2%、4.5%、3.9%。

四、臨床樣本測定

對臨床確診的35例CHD患者和30名健康體檢者血清進行芯片電泳分析。CHD組與健康對照組比較，sdLDL與 VLDL峰面積顯著增加(P ＜0.01)，HDL 峰面積顯著下降(P ＜0.001)。見圖5。

圖5 CHD組與正常對照組脂蛋白峰面積比較

討 論

納米材料可直接作為緩沖液添加劑使用。由于其具有比表面積大的突出特點，經有機改性后的納米材料添加到溶液中，有更多與樣本作用的位點，從而擔當了有機官能團與樣本分子相互作用的平臺，不僅使樣本的遷移速度發生變化，并且改變了電滲流，提高了分離選擇性。Neiman等[9]分別制備了使用檸檬酸和巰基丙酸離子穩定的2種金納米材料，添加到電解質溶液中，調整了芳香酸和芳香堿同分異構體的分離選擇性，并且提高了柱效。本研究在緩沖液中加入納米金提高脂蛋白分離效率及選擇性。迄今為止，瓊脂糖凝膠電泳是分離脂蛋白的常用實驗技術，但耗時且分辨率低，不能分離出脂蛋白亞型?；诩{米技術的芯片電泳快速、高效分離了血清脂蛋白及其亞型，結果穩定，可望成為替代凝膠類型分離脂蛋白的全新方法。

血脂分析對于臨床高脂血癥的診斷及動脈粥樣硬化性心血管病的危險評估和防治具有重要意義，并已經滲透應用于其他諸多臨床相關專業疾病的研究。近年國外研究特別重視LDL亞組分分析，將高sdLDL、高TG及低HDL-C血癥同時存在稱為血脂“異常三聯癥”。芯片電泳分離經密度梯度超速離心制備的LDL，LDL峰高與峰面積隨LDL濃度的增大而增加，顯示2種方法存在一定的相關性[10]。本研究通過進一步條件優化，芯片電泳檢測血清脂蛋白的結果顯示，CHD組sdLDL、VLDL水平增高，HDL水平降低，與對照組比較差異均有統計學意義(P ＜0.01，P ＜0.001)，與 Rizzo等[11]報道高 sdLDL、高 TG、低 HDL-C 為“動脈粥樣硬化脂蛋白譜”一致?；诩{米技術的芯片電泳可快速、簡便地測定脂蛋白及其亞型，對評價CHD的危險因素，實現對CHD的早期檢測、預防及有效制定CHD防治策略具有重大意義。

[1]Han J，Craighead HG.Separation of long DNA molecules in a microfabricated entropic trap array[J].Science，2000，288(5468):1026-1029.

[2]Van Oudenaarden A，Boxer SG.Brownian ratchets:molecular separations in lipid bilayers supported on patterned arrays[J].Science，1999，285(5430):1046-1048.

[3]Huang LR，Cox EC，Austin RH，et al.Continuous particle separation through deterministic lateral displacement[J].Science，2004，304(5673):987-990.

[4]MacDonald MP，Spalding GC，Dholakia K.Micro fluidic sorting in an optical lattice[J].Nature，2003，426(6965):421-424.

[5]He L，Toh CS.Recent advances in analytical chemistrya material approach[J].Anal Chim Acta，2006，556(1):1-15.

[6]Wang H，Wang HM，Jin QH，et al.Microchip-based small，dense low-density lipoproteins assay for coronary heart disease risk assessment[J].Electrophoresis，2008，29(9):1932-1941.

[7]Zhuang G，Jin Q，Liu J，et al.A low temperature bonding of quartz microfluidic chip for serum lipoproteins analysis[J].Biomed Microdevices，2006，8(3):255-261.

[8]Chen JF，Jin QH，Zhao JL，et al.A signal process method for DNA segments separation in microchannel electrophoresis[J].Biosens Bioelectron，2002，17(6-7):619-623.

[9]Neiman B，Grushka E，Lev O.Use of gold nanoparticles to enhance capillary electrophoresis[J].Anal Chem，2001，73(21):5220-5227.

[10]汪 驊，王惠民，金慶輝，等.微流控芯片電泳分離血清中小而密低密度脂蛋白的研究[J].分析化學，2008，37(11):1531-1534.

[11]Rizzo M，Berneis K.Low-density lipoprotein size and cardiovascular risk assessment[J].QJM，2006，99(1):1-14.