氨基葡萄糖對IL－1β誘導人骨關節炎軟骨細胞蛋白聚糖分解代謝的影響

楊建輝 呂建國 王 輝 申曉東 (西安交通大學第一醫院疼痛科，陜西 西安 710061)

蛋白聚糖是軟骨細胞分泌的一種蛋白多糖大分子，是關節軟骨細胞外基質的主要成分之一。在骨關節炎(OA)發病機制的研究中，人們發現蛋白聚糖和膠原纖維的降解是OA發病的主要生理和病理學基礎〔1〕。氨基葡萄糖不僅可以減輕OA疼痛癥狀，同時可以延緩OA的病理改變，為改變病情藥物〔2〕。本研究利用體外培養OA患者軟骨細胞體系，通過檢測軟骨細胞糖胺多糖(GAG)及蛋白聚糖代謝片段的變化，以及蛋白聚糖、可聚蛋白聚糖酶-1(Aggrecanase-1)和可聚蛋白聚糖酶-2(Aggrecanase-2)mRNA的表達，了解氨基葡萄糖對白細胞介素-1β(IL-1β)誘導OA軟骨細胞蛋白聚糖分解代謝的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 胰蛋白酶、細胞培養液達氏修正依氏培養基(DMEM)/F12(Gibco公司)，Ⅱ型膠原酶、IL-1β(Sigma公司)，噻唑藍(MTT，Amresco公司)，二甲基亞甲藍(DMMB，Serva公司)，硫酸軟骨素A(Seikagaku Kogyo公司)，總RNA提取試劑盒(RNeasy MiniKit，QIAGEN Pty Led Australia)，反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)試劑(華美生物制品公司)，抗蛋白聚糖單克隆抗體(monoclonal antibody，Mab)3B3及5D4(Invitrogen公司)，引物由上海生工生物工程有限公司提供。氨基葡萄糖(商品名:伊索佳-浙江海正藥業生產)。

1.2 含藥血清和正常兔血清的制備 根據文獻〔3〕，將氨基葡萄糖按體表面積折算動物的等效劑量，再用生理鹽水配成8 ml溶液給新西蘭大白兔灌胃，正常兔血清則以生理鹽水8 ml灌胃。連續2次灌胃，中間間隔2 h，在末次灌胃的3 h后，乙醚和氯胺酮復合麻醉下腹主動脈采血，4℃冰箱過液后，離心2 500 r/min ×25 min，抽取血清，56℃、30 min 滅活，經 0.45 μm濾膜抽濾除菌、分裝，－20℃保存備用。

1.3 軟骨細胞的分離與培養 軟骨細胞取自OA患者進行膝關節置換術的軟骨組織，參考文獻〔4〕，用尖刀片仔細分離脛骨平臺、股骨髁以及髕骨關節面的軟骨。將軟骨塊用D-Hank's液漂洗，剪碎至1 mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶消化30 min，然后再加入0.2%Ⅱ型膠原酶，置震蕩器上，37℃震蕩消化1 h，將游離出的帶有酶溶液的軟骨細胞用吸管吸出，120目尼龍網篩過濾，獲取軟骨細胞，細胞活力分析儀檢測細胞活力＞95%。將消化所得的細胞懸浮于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養基中，密度為105cells/ml(Vi-cell細胞活力分析儀計數)接種于25 cm2培養瓶中，置37℃ 5%CO2培養箱中培養，逐日倒置顯微鏡觀察，隔2～3 d換液，原代貼壁細胞單層融合后按1∶2傳代。第一代軟骨細胞采用MTT法檢測不同濃度IL-1β和含氨基葡萄糖血清兔血清存在條件下的細胞存活率，選擇細胞存活率均≥95%的適當IL-1β和含氨基葡萄糖血清濃度做進一步的實驗。結果IL-1β濃度為10 ng/ml，含氨基葡萄糖兔血清最高濃度為40%。

1.4 加藥培養 將第一代軟骨細胞轉入12孔的組織細胞培養板，每孔細胞數為1.5×105/L，培養48 h后，用不含小牛血清的培養液洗2次，此后的培養均采用無小牛血清的培養液，以去除小牛血清對GAG和蛋白聚糖分解片段測定的干擾。吸棄孔中培養液，進行試驗分組。實驗分為5組，A組(兔血清對照組):培養液中無任何刺激因子，每孔加入正常兔血清100 μl;B組(IL-1β對照組):培養液含10 ng/ml IL-1β+正常兔血清100 μl;C組:培養液含10 ng/ml IL-1β+10%含氨基葡萄糖血清100 μl;D組:培養液含10 ng/ml IL-1β+20%含氨基葡萄糖血清100 μl;E組:培養液含10 ng/ml IL-1β+40%含氨基葡萄糖血清100 μl;每組設4個復孔，連續培養48 h進行檢測。實驗重復3次。

1.5 溶解軟骨細胞用于測定細胞內GAG含量 全過程均在碎冰上進行。將細胞培養板移至碎冰上，用1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)輕柔洗細胞1次，然后每孔加人300 μl細胞溶解液，冰上作用20 min，將溶解液移至離心管，4℃離心10 min，收集上清液透析后儲存于－20℃，用于檢測細胞內GAG。

1.6 軟骨細胞及培養液中GAG的測定 GAG的含量測定是檢測蛋白聚糖代謝的一個常用指標〔5〕。體外軟骨細胞培養過程中，GAG釋放入培養液中的水平代表蛋白聚糖的降解程度，釋放入培養液中的GAG越多，表明蛋白聚糖的降解越明顯。本實驗采用GAG釋放至培養液中的量占總體GAG(細胞內+培養液)的百分率表示蛋白聚糖的降解程度。GAG的含量采用DMMB分光光度法測定〔2〕，以硫酸軟骨素A作為標準參照物，計算測定結果。

1.7 競爭性酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定蛋白聚糖的兩種代謝片段 Mab 3B3和5D4(購自Invitrogen公司)為兩種識別蛋白聚糖不同代謝片段的Mab。Mab-3B3可檢測蛋白聚糖中核心蛋白區硫酸軟骨素(CS)的特定片段，是蛋白聚糖合成的標記。Mab-5D4可與蛋白聚糖核心蛋白區的硫酸角質素(KS)鏈中重復出現的硫酸化己糖結合，是蛋白聚糖降解的標志物〔6〕。ELISA方法參照 Chan等〔7〕的方法，標準參照物為軟骨素酶處理后的蛋白多糖。

1.8 RT-PCR檢測軟骨細胞蛋白聚糖、可聚蛋白聚糖酶-1和可聚蛋白聚糖酶-2 mRNA的表達 選取經不同處理因素作用48 h的12孔板細胞，每孔加入1 ml Trizol按說明書提取總RNA;然后通過RT-PCR反轉錄合成cDNA，以18 S mRNA作為內對照，對比分析各組軟骨細胞內蛋白聚糖、可聚蛋白聚糖酶-1和可聚蛋白聚糖酶-2基因mRNA的表達量。各基因的上下游引物序列以及退火溫度見表1。PCR反應體系為:上下游引物各 0.5 μl，dNTP(10 mmol)2 μl，25 mmol MgCl22 μl，Taq DNA聚合酶 0.5 μl，cDNA 模板 2 μl，10 × PCR 緩沖液 2.5 μl，總反應體系25 μl。PCR反應擴增條件:90℃預變性5 min，進入循環，95℃變性45 s，分別在蛋白聚糖:55℃;可聚蛋白聚糖酶-1:60℃;可聚蛋白聚糖酶-2:60℃;18 S mRNA:57℃的溫度退火45 s后，72℃延伸45 s的條件下循環擴增，進行35個循環，72℃再延伸7 min。擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外分析儀下觀察擴增產物特異條帶。產物經凝膠成像及分析系統進行圖像分析，測定條帶的A值。以18 S作內參照，用蛋白聚糖、可聚蛋白聚糖酶-1和可聚蛋白聚糖酶-2條帶的A值與18S條帶的A比較，進行目的基因表達的半定量分析。

表1 半定量RT-PCR引物系列及產物長度

1.9 統計學處理 數據用SPSS11.0統計軟件處理，采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析(LSD)。

2 結果

2.1 GAG結果 比較5組細胞釋放入培養液的GAG百分比，其中B組最高(56.4±2.2)%，顯著高于C組(t=6.54，P＜0.01)、D 組(t=5.34，P ＜0.01)、E 組(t=5.34，P ＜0.01)和 A組(兔血清對照組)(t=6.24，P＜0.01);C組其次(40.4±2.2)%，明顯高于D組(23.4±2.4)%(t=4.98，P＜0.01)和E組(11.4±2.4)%(t=5.98，P＜0.01)，但與A組差異無統計學意義;A組(42.4±2.2)% 明顯高于D組和E組，差異有統計學意義(P均＜0.01);E組最低，與D組相比差異有統計學意義(P＜0.01)，提示氨基葡萄糖能夠抑制IL-1β對OA軟骨細胞蛋白聚糖分解的促進作用，對OA軟骨細胞蛋白聚糖的降解亦有明顯的抑制作用。

2.2 培養液中3B3片段含量的比較 見表2。E組最高、D組相對較高，與A組、B組相比差異顯著(P均＜0.01);其次是C組，與A組、B組相比差異顯著(P均＜0.05);B組、A組最低，二者相比差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.3 培養液中5D4片段含量的比較 見表2。B組最高，A組和C組次之，其次是D組，E組最低。B組與E組、D組、A組、C組相比差異均有統計學意義，其中 B組與 E組、D組相比(P均＜0.01);B組與A組、C組相比(P均＜0.05);A組與C組相比差異無統計學意義(P＞0.05);E組與D組相比差異有統計學意義(P＜0.05)。

表2 不同培養條件軟骨3B3片段、5D4片段含量比較(±s ，n=3)

表2 不同培養條件軟骨3B3片段、5D4片段含量比較(±s ，n=3)

與A組、B組比較:1)P＜0.01;2)P＜0.05;與B組相比:3)P＜0.05

組別 3B3片段 5D4片段A組 120.43±5.11 209.43±0.0213)B組 123.23±4.12 251.32±0.120 C組 144.32±5.152) 216.43±0.1133)D組 164.23±4.171) 190.45±0.0921)E組 204.14±5.181) 160.52±0.0811)

2.4 蛋白聚糖、MMPs-1及MMPs-3 mRNA的表達 各組軟骨細胞蛋白聚糖、可聚蛋白聚糖酶-1、可聚蛋白聚糖酶-2 mRNA相對含量(即與18 S mRNA A值的比值)的比較(見表3)。半定量RT-PCR顯示氨基葡萄糖加藥組的蛋白聚糖mRNA表達的均值均較對照組明顯增高，其中與B組相比(P均＜0.01)，D組、E組與 A組相比(P＜0.01)，C組與 A組相比(P＜0.05)，隨氨基葡萄糖濃度的增加，蛋白聚糖mRNA表達逐漸增加;氨基葡萄糖加藥組的可聚蛋白聚糖酶-1、可聚蛋白聚糖酶-2 mRNA表達均較對照組明顯降低，其中與B組相比(P均＜0.01)，E組、D組與A組(對照組1)相比(P＜0.01)，C組與A組相比(P＜0.05)，隨氨基葡萄糖濃度的增加，可聚蛋白聚糖酶-1、可聚蛋白聚糖酶-2 mRNA的表達逐漸降低。

表3 不同培養條件軟骨細胞蛋白聚糖、可聚蛋白聚糖酶-1和可聚蛋白聚糖酶-2表達強度比較(±s ，n=3)

表3 不同培養條件軟骨細胞蛋白聚糖、可聚蛋白聚糖酶-1和可聚蛋白聚糖酶-2表達強度比較(±s ，n=3)

組別 蛋白聚糖 可聚蛋白聚糖酶-1 可聚蛋白聚糖酶-2 A組 0.22±0.112) 0.673±0.0212) 0.422±0.1372)B組 0.12±0.121) 0.832±0.1201) 0.782±0.1141)C組 0.35±0.153) 0.568±0.1133) 0.331±0.1273)D組 0.84±0.16 0.420±0.092 0.232±0.007 E組1.25±0.18 0.280±0.081 0.101±0.007

與E組、D組、C組比較:1)P＜0.01;與E組、D組比較:2)P＜0.01;與A組相比:3)P＜0.05

3 討論

OA是以關節軟骨退變為主要表現的常見疾病，軟骨細胞功能異常導致蛋白聚糖的代謝紊亂是OA的特征之一〔1〕。既往OA被認為是一種非炎癥性的關節病變，但近年來大量的研究證實異常炎癥反應在OA的發病中起著重要的作用。已經證實，在骨關節炎關節中有過度的前炎性細胞因子如IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)和炎性介質NO等生成〔8〕。其中IL-1β是存在于OA軟骨及滑液中的重要炎性細胞因子，不僅抑制軟骨基質的合成，加速膠原和蛋白多糖的降解，而且誘導軟骨細胞的凋亡，已作為人工制作OA模型的誘導劑而廣泛使用〔9，10〕。氨基葡萄糖是治療OA的特異性藥物，有研究顯示氨基葡萄糖能夠刺激軟骨細胞產生蛋白多糖，參與透明質酸和多聚氨基葡萄糖的合成，同時具有抑制肉芽組織增生、血管滲出和細胞游離，有效改善關節炎的癥狀〔11〕。

蛋白聚糖是一種復雜的蛋白多糖大分子，它的主體結構主要由核心蛋白、3個球狀結構域和1個球間區組成;核心蛋白由大量的GAG鏈包繞，GAG占蛋白聚糖分子量的80%～90%〔12〕，是蛋白聚糖的決定性功能基團。研究認為，GAG更適合作為蛋白聚糖轉化的參考數值，軟骨細胞外基質蛋白聚糖解聚、降解，游離的GAG增多等，使得蛋白聚糖失去其正常結構和功能。當軟骨細胞功能異常導致蛋白聚糖的降解增多時，過多的GAG可被釋放到細胞外基質中，故檢測細胞外GAG的含量可反映蛋白聚糖的總體代謝情況〔13〕。OA動物模型關節液中GAG水平異常升高并與病程相關，且經IL-1β作用于OA患者的軟骨細胞后，釋放入培養液中GAG的百分比明顯升高，提示細胞因子IL-1β可促進蛋白聚糖的降解〔14〕。本研究結果驗證了IL-1β的確可促進蛋白聚糖的降解，并隨氨基葡萄糖濃度的增加，釋放入培養液中GAG的百分比逐漸降低。說明氨基葡萄糖能夠抑制IL-1β對OA軟骨細胞蛋白聚糖分解的促進作用，對OA軟骨細胞蛋白聚糖的降解亦有明顯的抑制作用。

當軟骨細胞功能異常時，過多的蛋白聚糖酶及多種基質金屬蛋白酶可作用于蛋白聚糖的不同部位，產生不同的代謝片段。目前針對于蛋白聚糖不同代謝片段的Mab廣泛用于蛋白聚糖的代謝研究，它可特異性地與蛋白聚糖的不同代謝片段結合，從而了解蛋白聚糖的代謝狀況〔15〕。Mab-3B3和5D4是分別識別CS和KS兩種GAG的單克隆抗體，其中Mab-3B3可檢測CS區末端天然的CS鏈，它所檢測的3B3片段大量見于胎兒軟骨及新合成的軟骨中，正常成熟的軟骨中幾乎檢測不到，故研究者認為3B3是蛋白聚糖合成的標記物。研究發現，在早期兔的OA模型中，關節液中3B3片段明顯升高，而晚期卻檢測不到，故認為OA病變早期蛋白聚糖合成活躍可能有利于修復和重建損傷的軟骨組織〔16〕。Mab-5D4可與蛋白聚糖的核心蛋白區KS鏈中重復出現的硫酸化六糖結合，可以檢測蛋白聚糖代謝所產生的KS片段，是蛋白聚糖降解的標志物。本實驗說明氨基葡萄糖不但能夠抑制OA患者蛋白聚糖的降解，而且能夠抑制IL-1β誘導的OA患者蛋白聚糖的降解，同時可增加蛋白聚糖合成，達到治療OA的目的。但IL-1β只具有促進蛋白聚糖降解的作用，而無促進蛋白聚糖合成的作用。

關節軟骨破壞有兩種途徑:一種是內在途徑，即軟骨細胞自身降解軟骨細胞外基質;另一種是外在途徑，如炎癥滑膜、血管翳組織、浸潤的炎癥細胞，通過關節滑液破壞軟骨細胞外基質。兩種途徑中酶性降解細胞外基質是軟骨破壞的主要原因〔17〕。除基質金屬蛋白酶(MMPs)外，可聚蛋白聚糖酶-1和可聚蛋白聚糖酶-2是近年來發現的兩種重要的蛋白聚糖降解酶，在OA患者的關節軟骨中，這兩種酶的mRNA表達均明顯增高〔18〕。不同于MMPs作用于蛋白聚糖核心蛋白球間區域(IGD)Asn341 Phe342位點，可聚蛋白聚糖酶的作用部位則是蛋白聚糖核心蛋白IGD區域 Glu373 Ala374位點，而且該位點被認為是蛋白聚糖降解的關鍵部位〔19〕。隨后的研究發現，Aggrecanase介導的蛋白聚糖降解在OA軟骨退變中首先發生，依賴MMPs的蛋白聚糖核心蛋白的降解開始大約3 w后才能檢測到，與此同時，膠原的降解才開始發生〔20〕。并且同時抑制可聚蛋白聚糖酶-1和可聚蛋白聚糖酶-2能防止關節軟骨的蛋白聚糖降解，據此相信，Aggrecanase介導的蛋白聚糖降解，在軟骨細胞外基質代謝平衡異常的退變破壞過程中不僅起重要作用，而且可能是事件的始發者〔18〕。本研究觀察到代表核心蛋白降解的5D4片段明顯升高，推測這兩種酶可作用于人軟骨蛋白聚糖的核心蛋白區，導致蛋白聚糖的降解。

1 Krasnokutsky S，Samuels J，Abramson SB.Osteoarthritis in 2007〔J〕.Bull NYU Hosp Jt Dis，2007;65(3):222-8.

2 皮俊杰，呂志偉，閆志榮，等.前交叉韌帶切斷誘導兔膝骨關節炎模型:阿侖磷酸鈉與鹽酸氨基葡萄糖對其關節軟骨和軟骨下骨的保護作用〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2010;14(28):5151-4.

3 詹紅生，趙詠芳，馮 偉.含藥血清方法在中藥調節骨與軟骨代謝基礎研究中的應用〔J〕.中國骨傷，2000;13(11):661-2.

4 司徒鎮強，吳軍正.細胞培養〔M〕.西安:世界圖書出版西安公司，2004:21-3.

5 Farndale RW，Buttle DJ，Barrett AJ.Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue〔J〕.Biochem Biophys Acta，1986;442(883):173-7.

6 Garnero P，Rousseau TC，Delmas PD.Molecular basis and clinical use of biochemical markers of bone，cartilage，and synovium in joint disease〔J〕.Arthritis Rheum，2000;12(43):953-68.

7 Chan SS，Kent GN，Will RK.A sensitive assay for the measurement of serum chondroitin sulfate 3B3(-)epitope levels in human rheumatic disease〔J〕.Clin Exp Rheumatol，2001;7(19):533-40.

8 Jatvinen K，Vuolteenaho K，Nieminen R，et al.Selective inNOS inhibitor 1 400 W enhances anti-catabolic IL-10 and reduces destructive MMP-10in OA cartilage.Survey of the effects of 1 400 W on inflammatory mediators produced by OA cartilage as detected by protein antibody array〔J〕.Clini ExpRheumatol，2008;26(2):275-82.

9 de lsla NG，Stoltz JF.In vitro inhibition of IL-1 beta catabolic effects on cartilage:a mechanism involved on diacerein anti-OA properties〔J〕.Biorheology，2008;45(34):433-8.

10 Schuerwegh AT，Dombrecht ET，Stevens WJ，et al.Influence of pro-inflammatory(IL-alpha，IL-6，IFN-gamma)and anti-inflammatory(IL-4)cytokines on chondrocyte function〔J〕.Osteoarthritis Cartilage，2003;11:681-7.

11 張偉斌，莊澄宇，李健明，等.鹽酸氨基葡萄糖治療骨性關節炎有效性與安全性評價〔J〕.中華外科雜志，2007;45(14):998-1001.

12 Kiani C，Chen L，Wu YJ，et al.Structure and function of aggrecan〔J〕.Cell Res，2002;12(14):19-32.

13 Pottenger LA，Webb JE，Lyon NB.Kinetics of extraction of PG from human cartilage〔J〕.Arthritis Rheum，1985;28(3):323-30.

14 Innes JF，Little CB，Hughes CE，et al.Products resulting from cleavage of the interglobular domain of aggrecan in samples of synovial fluid collected from dogs with early-and late-stage osteoarthritis〔J〕.Am J Vet Res，2005;66(34):1679-85.

15 Caterson B，Flannery CR，Hughes CE，et al.Mechanisms involved in cartilage proteoglycan catabolism〔J〕.Metrix Biol，2000;19(13):333-44.

16 Lovasz G，Park SH，Ebramzadeh E，et al.Characteristics of degeneration in an unstable knee with a corona surface step-off〔J〕.J Bone Joint Surg(Br)，2001;83-B:428-36.

17 Yasuo Y，Hiroyuki N，Kenichi O，et al.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in synovial fluids from patients with rheumatoid arthritis or osteoarthritis〔J〕.Ann Rheum Dis，2000;59(12):455-61.

18 Malfait AM，Liu RQ，Ijiri K，et al.Inhibition of ADAM-TS4 and ADAMTS5 prevents aggrecan degradation in osteoarthritic cartilage〔J〕.J Biol Chem，2002;21:22201-8.

19 Caterson B，Flannery CR，Hughes，et al.Mechanisms involved in catabolism〔J〕.Matrix Biol，2000;19(6):333-4.

20 Little CB，Hughes CE，Curtis CL，et al.Matrix metalloproteinases are involved in C-terminal and interglobular domain processing of cartilage aggrecan in late stage cartilage degradation〔J〕.Matrix Biol，2002;21(9):271-88.