嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌混菌發酵合成共軛亞油酸的動力學

于 田，王 際 輝，龐 宇 辰，葉 淑 紅，肖 珊，王 晗

(大連工業大學 遼寧省食品生物技術重點實驗室，遼寧 大連 116034)

0 引 言

共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)是含有共軛雙鍵的一系列亞油酸，由必需脂肪酸亞油酸衍生的共軛雙烯的多種位置與幾何異構體的總稱[1]。CLA 在抗癌[2]、抗氧化[2－3]、降脂[4]和免疫調節[5－6]方面都有著很強的生物活性。CLA的合成法主要有2種，第1種是堿法異構化，目前主要采用此法，可實現大量生產，然而產物組成相對復雜，并不利于產品的研發與應用；第2種是微生物合成法，反應條件溫和，優點是產物與天然食物中的CLA相似，主要具有c9，t11－CLA和10t，12c－CLA這2種生理活性的異構體，有利于產品的研發與應用。

微生物生長代謝過程相當復雜，想要建立分批發酵過程的機制模型幾乎是沒有可能的，而數學擬合模型建立起來相對簡單并可通過分析驗證，計算自動化也易于實現。通過模型的建立可以更好地了解微生物的代謝過程，尋找最佳發酵條件，提高產量。本研究利用益生菌嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌混菌發酵合成CLA，對其發酵過程進行動力學研究，建立了動力學模型，并應用Ori－gin 8.0軟件對數據擬合得到模型中參數，為放大實驗數據，優化發酵工藝提供理論依據。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌 株

嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌，大連工業大學食品學院實驗室保藏菌株。

1.1.2 培養基

脫脂乳培養基：脫脂乳12%，經10min 115℃滅菌。

1.1.3 主要儀器與試劑

RE－52A型旋轉蒸發儀；SG46－280S不銹鋼手提式蒸汽滅菌鍋；Phs－3C精密pH計；UV775B紫外分光光度計；伊利高蛋白脫脂高鈣奶粉；紅花籽油，食品級；Tween－80，食品級；CLA 標準品，Sigma公司；正己烷、甲醇、氯仿、無水硫酸鈉，國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅花油水解乳化液的制備

將亞油酸與Tween－80以質量比2∶1溶于去離子水中，使亞油酸終質量濃度為50mg／mL，加少量蒸餾水進行混合，然后進行超聲乳化分散。超聲條件是超聲功率400W，工作5s，間歇5s，乳化15min，在冰水浴條件下進行。然后用0.22μm微孔濾膜對紅花油水解乳化液過濾除菌，4℃保藏備用。

1.2.2 發酵方法

嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌以1∶1、接種量3%、紅花油水解乳化液添加量4%加入脫脂乳培養基，41℃恒溫培養17h。

1.2.3 菌體干重

接種的發酵液離心分離后，經85℃烘干至恒重，與未接種發酵液的差值即為菌體干重。

1.2.4 CLA提取方法

經脫脂乳發酵后，向發酵乳中加入甲醇和氯仿混合物，V(甲醇)∶V(氯仿)＝1∶2，經過10 000r／min、20min、4℃冷凍離心，下層的有機相收集起來。添加無水硫酸鈉進行干燥，旋轉蒸發儀在30℃條件下蒸發脫去溶劑，殘余物再轉移到螺口試管[7]。

1.2.5 CLA含量的測定

CLA吸收值在波長233nm處測定，然后進行標準曲線的繪制。得到標準曲線為y＝0.179 1x＋0.101 4，R2＝0.999[8]?！?.2.4”中的提取物使用正己烷溶解，在波長233nm處進行檢測，通過計算得到共軛亞油酸的含量。

1.3 計算工具軟件

采用Origin 8.0進行非線性擬合[9]。

2 結果與討論

2.1 CLA發酵過程動力學曲線

測定發酵過程中參數如圖1所示。菌體生長：0～1h菌體生長緩慢，屬于適應培養環境的階段；從2h起進入對數生長期；8～10h菌體進入穩定期。合成CLA產物：0～7h合成速度緩慢；8h后加快合成產物速度；12h后快速合成產物CLA；14h時，CLA達到最大的合成速度。發酵液的pH：整個發酵過程pH呈下降趨勢。從圖1可以看出，在前8h主要是菌體的生長階段，合成CLA的量很少，主要是因為亞油酸異構酶為誘導酶，它的產生需要一個過程，培養時間短酶活力較低；但是在8h之后，pH范圍為4.7～5.5，菌體量相對穩定，CLA大量合成，因為此時環境pH為亞油酸異構酶的最適pH[10]。

圖1 CLA發酵動力學曲線Fig.1 The kinetic curve of batch fermentation

2.2 菌體的生長動力學模型

通常描述菌體生長的模型是Monod方程[11]，該模型適合細胞生長慢、密度低的情況。由圖1可知，乳酸菌生長迅速、密度大不適于Monod方程，而適合于S型曲線，即Verhulst－Pearl提出的Logistic模型。在分批發酵過程中Logistic模型很好地反映出菌體濃度的增加，因此本實驗采用Logistic模型描述并擬合菌體生長規律，即

式(1)中：μmax為最大的生長速率；Cxmax為菌體的生長上限。

剛開始分批發酵，Cx／Cxmax忽略不計，因為菌體濃度Cx遠小于Cxmax，方程(1)表示對數生長的菌體；菌體結束對數生長期進入穩定期，即Cx＝Cxmax，方程(1)表示停止生長的菌體。在0～t，對方程(1)的兩邊分別積分，可以得到：

式(2)中：Cx0為初始菌體干重，mg／mL，本實驗中測得Cx0＝0.007mg／mL；Cxmax為最大菌體干重，mg／mL，本實驗中測得Cxmax＝1.105mg／mL。

將Cx0，Cxmax實驗值帶入公式(2)，整理得：

利用最小二乘法，使殘差平方和最小，即滿足

式(4)中：M為實驗數據組數；re為測定的實驗值；rs為計算的模型值。

非線性擬合菌體生長動力學模型式(3)如圖2得到擬合結果，擬合公式為y＝1.105／[1＋exp(5.06－Kx)]，得到K＝0.977 63。

圖2 菌體的生長動力學模型曲線Fig.2 The kinetic model fitting curve of cell growth in the fermentation

如圖2所示，微生物生長過程的實驗點數據和菌體生長動力學模型數據都能較好的擬合，R2＝0.985 09。因此，此模型可以作為以后放大實驗的參考。

2.3 CLA產物合成動力學模型

目前還不能用統一的模型來描述代謝產物生成動力學，因為微生物的生長代謝是一個非常復雜的過程。通過研究產物的合成速率與細胞的生長速率的相互關系，細胞合成代謝產物的規律被Gaden分為3類[14]：

(1)相關模型：細胞的生長和產物的合成是相關的，基質的分解代謝產物通常就是產物。

(2)部分相關模型：產物合成和基質消耗是間接相關的。合成的產物是能量代謝的間接結果。

(3)非相關模型：產物合成和細胞生長無直接的關系。在細胞生長過程中，沒有產物積累，停止細胞生長后，開始合成產物。

由發酵動力學曲線圖1知，乳酸菌合成CLA過程是屬于部分相關模型。Luedeking－Piret方程用于描述部分相關模型，動力學方程式可表示為：

式(5)中：a，b是合成產物動力學模型中的參數；是與菌體相關的產物的形成率；bCx是與非伴隨菌體生長的產物的形成率。

對公式(3)左右兩邊分別求導，整理得：

將公式(3)、(6)代入式(5)，整理得：

在0～t對方程(7)左右兩邊積分，整理得：

將K＝0.977 63代入公式(8)，整理得：

利用Origin 8.0軟件非線性擬合菌體生長動力學模型式(9)，如圖3所示的擬合結果，同時由軟件處理得到了擬合公式為：

得到a＝－15.862 58，b＝8.262 57。

如圖3所示，微生物合成CLA過程的大部分實驗點的數據和CLA產物合成動力學模型的數據擬合較好，R2＝0.986 75。因此，此模型可以作為以后放大實驗的參考。

2.4模型擬合值與實驗值的比較

利用Origin 8.0軟件，通過發酵動力學模型數學表達式的建立，擬合得到模型參數值，可知在整個乳酸菌混菌發酵合成CLA的過程中隨著時間的變化菌體量和CLA合成量的擬合值，結果如表1所示。

圖3 CLA合成動力學模型的擬合曲線Fig.3 The kinetic model fitting curve of CLA producing

表1 發酵動力學模型計算值和實驗值比較Tab.1 Comparison of computed and experimental data of fermentation kinetics model

從表1可知，實驗值與擬合值基本接近，擬合情況較好，說明所建立的模型能較好地反映出嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌混菌發酵合成CLA的過程。

3 結 論

研究了嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌混菌合成CLA的發酵動力學，并通過Origin 8.0軟件分析得到了菌體生長和CLA合成量兩個動力學模型及其參數，相關系數R2分別為0.985 09和0.986 75，說明該模型基本上能夠描述嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌混菌合成CLA的發酵過程，可為實際工業化生產提供理論依據。

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