布魯氏菌omp28基因的克隆、表達及重組蛋白的反應原性分析

王秀麗，蔣玉文，毛開榮，丁家波，程君生，王 楠

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

隨著分子生物學和免疫學技術的不斷發展，目前報道的布魯氏菌外膜蛋白有7種，免疫印跡從羊種布魯氏菌中發現外膜蛋白28(OMP28)是用于診斷的重要抗原。在印度也有不同的實驗室用OMP28－ELISA檢測布魯氏菌的抗體，且效果良好［1－3］。將OMP28蛋白的核酸序列在 GenBank中BLAST搜索，發現有21個布魯氏菌株含有與羊種布魯氏菌16M株的omp28序列同源性為100%的序列，11株同源性為99%，且細微的差別對蛋白的生物活性不造成影響，證明omp28在布魯氏菌中是非常保守的序列，所以對omp28基因的克隆與表達對于新的布魯氏菌抗體檢測方法的研究有十分重要的意義。

1 材料與方法

1．1 菌株及試劑 羊種布魯氏菌16M株、羊種布魯氏菌M28株、犬種布魯氏菌、綿羊附睪種布魯氏菌、牛種布魯氏菌A19株、豬種布魯氏菌S2株由中國獸醫藥品監察所保存;羊布魯氏菌病陽性血清由哈爾濱獸醫研究所提供，感受態細胞BL21、DH5α由天根生化科技有限公司提供;pET32a載體由本實驗室保存，rTaq酶、Eco RⅠ內切酶、XhoⅠ內切酶、simple pMD18－T載體由大連寶生物(TaKaRa)公司提供。

1．2 方法

1．2．1 目的基因的擴增 用DNA快速提取試劑盒提取羊種布魯氏菌16M株、羊種布魯氏菌M28株、犬種布魯氏菌、綿羊附睪種布魯氏菌、牛種布魯氏菌A19株、豬種布魯氏菌S2株的基因組，參考GenBank公布的布魯氏菌16M株的omp28基因序列，用Mega4．0分析軟件對omp28基因進行序列分析，設計上游引物Fomp28和下游引物Romp28，在上游和下游引物上分別添加Eco RⅠ和XhoⅠ 酶切位點。并將omp28基因的終止子TAA去掉，并添加一個堿基A使其在載體中正確表達。引物序列如下:Fomp28，CGGAATTCATGAACACTCGTGCTAG，(劃線部分為 Eco RⅠ的酶切位點)，Romp28，CGGCTCGAGACTTGATTTCAAAAAC(劃線部分為XhoⅠ的酶切位點)，以Fomp28、Romp28為引物，按94℃ 10 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃2 min(30 個循環)，72℃ 10 min的程序擴增目的片段。用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR擴增的結果，用瓊脂糖凝膠DNA玻璃奶純化回收試劑盒回收目的片段。

1．2．2 omp28基因的克隆、核酸序列/氨基酸序列比對及親水性分析 估算T載體與目的片段之間的摩爾比，控制在1∶3～1∶8之間，將擴增的不同種布魯氏菌omp28基因分別與T載體連接，篩選陽性克隆，送上海生工生物技術有限公司測序。將不同種布魯氏菌omp28基因的測序結果以及基因編碼的氨基酸序列用Mega4．0分析并進行序列比對。分別對omp28基因編碼蛋白的氨基酸序列進行親水性分析。

將羊種布魯氏菌16M株的omp28基因序列在GenBank中BLAST，搜索與omp28基因核苷酸序列相似性較高的基因。

1．2．3 pET32a－omp28表達載體的構建及鑒定

將羊種布魯氏菌16M株的omp28基因的T載體克隆和pET32a載體同時用Eco RⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收酶切產物，將omp28基因亞克隆到pET32a表達載體中，篩選陽性克隆，經PCR鑒定和酶切鑒定正確后送上海生工生物技術有限公司測序，陽性克隆命名為pET32a－omp28。

1．2．4 重組菌的誘導表達及表達產物的鑒定 取鑒定為陽性的重組質粒以及pET32a空質粒分別轉化到BL21宿主細胞中，挑取pET32a－omp28重組菌單菌落接種于100 mL含100μg/mL Amp的 LB液體培養基中，在37℃以200 r/min的速度振蕩培養5 h。加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，分別在37℃和28℃ 200 r/min誘導表達6 h。挑取pET32a空質粒重組菌單菌落在37℃同上振蕩培養5 h后加入終濃度為1 mmol/L的IPTG繼續誘導表達6 h，作為對照。

將誘導后菌液45 mL以10000 r/min離心，將沉淀重懸于15 mL PBS中，超聲波裂解菌體，裂解條件為工作5 s，間歇5 s，20個循環。處理后再次離心。沉淀再次用30 mL pH 7．4的PBS重懸，分別取菌液離心后上清、經超聲波處理后上清、超聲波處理后沉淀200μL，加入50μL 5×loading buffer混勻后煮沸10 min，各取10μL上清液與標準分子量蛋白Maker上樣，恒壓120 V，SDS－PAGE至溴酚藍電泳至凝膠底部。取下凝膠用30 mL考馬斯亮藍染色液染色30 min，加50 mL脫色液在脫色搖床上脫色三遍，1 h/次，至條帶清晰，觀察結果，分析表達形式。

1．2．5 重組蛋白的 Western－blot分析 SDSPAGE結束后，通過Bio－Rad電轉儀將蛋白條帶轉移至PVDF膜上。120 mA恒流，低溫轉印1．5 h。轉印完畢，用TBST漂洗后，置于5%的脫脂奶粉中，于4℃冰箱過夜封閉。然后TBST洗三次，每次5 min。將膜置于1∶50倍稀釋的羊布魯氏菌陽性血清中，37℃搖床低速結合1 h。TBST洗三次，每次5 min。再將膜置于1∶20000倍稀釋的HRP標記的兔抗羊IgG抗體中，作用1 h。TBST洗三次，每次5 min。最后用OPD底物緩沖系統顯色并觀察結果。

2 結果

2．1 不同種布魯氏菌omp28基因擴增結果 以羊種布魯氏菌16M株、羊種布魯氏菌M28株、犬種布魯氏菌、綿羊附睪種布魯氏菌、牛種布魯氏菌A19株、豬種布魯氏菌S2株的基因組為模板，以Fomp28、Romp28為引物擴增出大小為751 bp的omp28基因片段，與預期結果相符(圖1)。

圖1 不同種布魯氏菌omp28基因擴增結果

2．2 不同種布魯氏菌omp28基因的克隆、序列比對及親水性分析 將羊種布魯氏菌16M株、羊種布魯氏菌M28株、犬種布魯氏菌、綿羊附睪種布魯氏菌、牛種布魯氏菌A19株、豬種布魯氏菌S2株的omp28基因的T載體克隆為模板，以Fomp28和Romp28為引物，分別進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，PCR可以擴增出與預期大小(751 bp)一致的條帶，初步證明克隆的質粒是正確的(圖2)。

用Mega 4．0對不同種布魯氏菌的omp28基因測序結果及基因編碼蛋白氨基酸的序列進行比對，結果顯示，omp28基因的核苷酸序列在不同種布魯氏菌中總共有6個位點存在差異，但編碼的蛋白質僅有2個氨基酸發生變化。序列之間堿基的差異以及對編碼氨基酸的影響見表1。不同種布魯氏菌OMP28親水性分析結果顯示，OMP28的親水性區域主要集中在1～130個氨基酸形成的多肽段，個別氨基酸的變化對整個蛋白親水性影響不大，而蛋白的抗原決定位點主要集中在親水區域，因此推斷，該兩個氨基酸的變化對OMP28蛋白的抗原性無影響。

將羊種布魯氏菌16M－omp28基因在GenBank中BLAST，搜索結果顯示，不同種布魯氏菌及疫苗株omp28基因的相似性在99%以上，而在沙門氏菌、大腸桿菌O∶157、小腸結腸炎耶爾森菌O∶9中不存在。

表1 不同種布魯氏菌omp28基因序列差異及對氨基酸的影響

2．3 重組表達載體pET32a－omp28的構建及鑒定

以重組質粒pET32a－omp28為模板，Fomp28、Romp28為引物PCR擴增，能擴增出與預期大小相符合的核酸條帶(圖3)。用Eco RⅠ和XhoⅠ對重組質粒進行雙酶切，切下的小片段與預期大小一致，與PCR方法擴增的片段大小一致，結果見圖4。

將重組的pET32a－omp28質粒送上海生工測序，測序結果與GenBank中的序列比對，發現與公布的16M株omp28基因的相似性為100%，核酸序列、編碼氨基酸序列也與公布的完全一致，說明插入載體的序列完全正確且不存在移碼或核苷酸的缺失等現象。

2．4 重組菌的誘導表達及表達產物的鑒定 將37℃和28℃誘導的菌體分別經超聲波處理后，將菌液離心后的上清、超聲波處理后的上清、超聲處理后的沉淀經SDS－PAGE分析，結果顯示37℃誘導的重組蛋白主要在超聲波處理后的沉淀中，說明主要是以包涵體的形式存在，而28℃誘導表達的菌體重組蛋白主要在超聲波處理后的上清中，說明重組蛋白主要是以可溶性的胞漿蛋白的形式存在(圖5)。

2．5 重組蛋白的反應原性分析 Western－blot分析結果表明，pET32a－OMP28重組蛋白無論是以包涵體形式存在還是以可溶性形式存在，都能與布魯氏菌的陽性血清發生反應，說明該蛋白的反應原性良好，結果見圖6。

圖2 不同種布魯氏菌omp28基因PCR鑒定結果

圖6 OM P28蛋白W estern-blot反應原性分析

3 討論

關于布魯氏菌的蛋白能否用于布魯氏菌病的診斷，國內外進行了大量的研究。不同株布魯氏菌的外膜蛋白在20世紀80年代首次被鑒定具有免疫原性和抗原保護力［4］。布魯氏菌的 OMP10、OMP25、OMP31、BCSP等蛋白也都曾經有人用原核表達系統或真核表達系統表達及對重組蛋白的抗原性進行研究，且證明以上蛋白都有不同程度的反應原性［5－8］。

文獻報道用重組布魯氏菌OMP28蛋白作抗原檢測布魯氏菌病 IgG抗體效果良好［1－3］?；蛐蛄蟹治龊偷鞍子H水性分析預測，個別氨基酸的差異不會影響OMP28蛋白的抗原性;在GenBank中搜索omp28基因的相似序列，結果顯示不同種布魯氏菌omp28基因的相似性大于99%，且僅存在布魯氏菌中。因此本研究僅構建了具有代表性的羊種布魯氏菌16M－omp28的重組表達載體，分析OMP28蛋白的反應原性。Western－blot結果表明本研究所獲得的重組OMP28反應原性良好，可以作為抗原檢測布魯氏菌病IgG抗體，解決脂多糖(LPS)作為抗原無法檢測粗糙型布魯氏菌感染的問題。

布魯氏菌pET32a－OMP28重組蛋白在37℃誘導表達時由于蛋白表達速度過快，來不及折疊即以包涵體的形式沉淀，而通過28℃低溫誘導，該蛋白主要以可溶性形式表達。選擇28℃低溫誘導表達OMP28蛋白不僅有利于OMP28蛋白更好的恢復天然結構，提高抗原的反應原性，而且便于蛋白的純化。

在GenBank中搜索布魯氏菌omp28基因的同源序列結果顯示，omp28基因在與布魯氏菌存在血清學交叉反應的小腸結腸炎耶爾森菌O∶9、都柏林沙門氏菌、大腸桿菌 O∶157中不存在，因此，用OMP28蛋白作抗原檢測布魯氏菌病，可以有效解決布魯氏菌病與小腸結腸炎耶爾森菌等血清學診斷中的交叉反應，顯示其有良好的應用前景。

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