水產中孔雀石綠和結晶紫殘留量測定前處理方法的優化研究

劉 輝 譚素嫻 何藝梅

(茂名出入境檢驗檢疫局 廣東茂名 525000)

1 前言

孔雀石綠和結晶紫屬于三苯甲烷類人工合成有機染料，它們及其代謝產物具有致癌性，我國于2002年將其列為水產養殖禁用藥物。由于染料藥物與組織蛋白結合非常強，而且魚和脂肪組織中所含的脂肪會產生乳化作用，因此對其進行檢測的關鍵在于前處理，單一溶劑萃取的效果不甚理想[1]?，F在比較好的提取方法是離子對提取法，國標GB/T19857-2005《水產中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定》[2]也是采用該方法。但在實踐過程中，GB/T19857-2005存在如下不足：有機溶劑用量大，操作步驟繁雜，檢測成本高等。因此，本研究結合工作需要，在國標的基礎上進行了優化，創造出一種類似QuEChERS的方法[3]。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗樣品

試驗樣品為送檢的凍羅非魚和凍蝦。

2.1.2 儀器

Quattro Premier XE UPLC-MS/MS：Waters公司；渦旋振蕩器：IKA公司；P-12平行蒸發儀：Buchi公司；超聲儀：上?？茖С晝x器有限公司；3-18K 高速離心機：Sigma公司。

2.1.3 試劑

乙腈、二氯甲烷、乙酸銨：Fisher，均為色譜純；甲酸：TEDI，色譜純；無水硫酸鈉：優級純；C18散裝填料：BESEP；孔雀石綠（MG）、隱性孔雀石綠（LMG）、結晶紫（CV）、隱性結晶紫（LCV）標準品：德國Dr公司。

2.2 方法

2.2.1 儀器工作條件

2.2.1.1 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18 1.7μm（2.1×50 mm）；柱溫：40℃；進樣體積：10μL；流動相：A（5mmol/L乙酸銨+0.1% FA）-B（乙腈），梯度見表1。

表1 液相色譜梯度表

2.2.1.2 質譜條件

毛細管電壓：3.5KV；源溫：120℃；脫溶劑溫度：450℃；脫溶劑氣流速：600 L/h；采集方式：ES(+),MRM方式；離子對信息：詳見GB/T19857-2005。

2.2.2 測定方法

2.2.2.1 樣品制備

稱取3.00g樣品于50mL聚四氟乙烯離心管中，加入30ng/mL的內標混合液100μL，然后加入10.00mL乙腈，高速渦旋混合使其充分分散；再加入5mL 0.1mol/L的乙酸銨緩沖液（pH=4.5），0.5g C18散裝填料，3g無水硫酸鈉，渦旋混勻；超聲10min，12000r/min離心5min，上清液全部倒入另一離心管中；加入5.00mL二氯甲烷，渦旋混勻，離心5min；吸取10.00mL上清液于平行蒸發儀的試管中，45℃下蒸干；準確加入1.00mL乙腈-5mmol/L乙酸銨（含0.1%FA）（1:1）洗脫、定容，過0.20μm濾膜后上機測定。

2.2.2.2 校準曲線的配制

稱取空白樣品6份，按2.2.2.1處理（不加內標），最終每個樣品定容到2mL；混合6個空白樣品的定容液作為基質液，然后用基質液作為稀釋液，配制如下濃度的校準曲線：0、0.5、1、2、5、10ng/mL，內標加入量按2ng/mL加入。上機測定，各項目回歸方程線性關系良好，r＞0.999。

3 結果

3.1 方法檢測限

經過優化的方法所有指標的檢測限均≤0.5μg/kg，與現行國標方法相當。0.5μg/kg濃度空白樣品加標總離子流圖見圖1，從圖中可見所有指標均有比較好的峰形與信噪比（S/N≥50）。

圖1 0.5μg/kg加標樣品總離子流圖

3.2 基質抑制率比較

質譜方法容易受到基質的干擾，一個好的方法必須要將基質抑制率降到最低?；|抑制率的計算方法是：在同一濃度水平下，用流動相配制的標準響應峰面積減去用基質液配制的標準響應峰面積，然后除以用流動相配制的標準響應峰面積。方法的基質抑制率越低其凈化效果就越好。本研究用相應的基質液配制濃度為1.0ng/mL的標準，每個平行測定6次計算平均值。比較GB/T19857-2005和本研究方法的基質抑制率，結果見表 2。

表2 基質抑制率比較表（n=6）

（續表）

表2顯示本方法的基質抑制率與國標方法基本相當，凈化效果基本一致。另外表2還顯示：一方面不同的產品有不同的基質抑制率，蝦的基質抑制率比較魚略大；另一方面不同項目的基質抑制率也不同，對LMG、LCV的抑制要明顯大于MG、CV。

3.3 方法的回收率與精密度

取日常檢測的凍羅非魚和凍蝦作為樣品，進行空白加標回收試驗，加標濃度為：0.5、1.0、5.0μg/kg三個水平，每個濃度分別制備6份，上機測定計算回收率和RSD，結果見表 3。

表3 不同介質及不同濃度下的加標回收率（n=6）

3.4 實際樣品測定

在過去的一年中，運用該方法對實驗送檢的1500多個樣品進行了檢測，檢到陽性樣品4個。陽性樣品均送上級檢驗部門復核，復核結果和檢測結果完全符合，說明該方法具有較好的穩健性和準確性。其中一個陽性樣品（LMG:0.64μg/kg）冰箱留樣復檢圖見圖2。

圖2 LMG陽性（0.64μg/kg）復檢離子流圖

4 討論

4.1 提取緩沖液的選擇

在優化過程中，考察了不同的緩沖體系（甲酸銨、乙酸銨、磷酸鹽），不同的緩沖液濃度（0.05、0.1、0.2、0.5mol/L）和不同的pH值（3、3.5、4、4.5、5、9）對提取效率的影響。結果顯示：乙酸銨緩沖體系提取結果相對干凈；同一緩沖體系在同一pH值下，不同濃度的緩沖液對提取結果影響不大；pH是影響最大的因素，pH為4.5-5時最合適，其他范圍MG均受到不同程度的破壞，特別是在pH=9的時候，MG基本破壞盡，上機幾乎檢測不到峰值。所以在參考國標的基礎上選定0.1mol/L的乙酸銨（pH=4.5）作為提取緩沖液。

4.2 方法凈化原理分析

水產樣品分析過程中，主要干擾物是油脂和蛋白。本研究主要利用有機溶劑沉淀蛋白，C18散裝填料近年來在國際多獸藥殘留檢測中有比較廣泛的應用，主要用于吸附油脂[4-5]。乙酸銨緩沖液作為離子對試劑，硫酸鈉作為鹽析試劑，二氯甲烷作為極性改進劑，改變乙腈的極性使其能與水層完全分離，而且乙腈與二氯甲烷的比例必須大于或等于2：1，否則乙腈層與水層無法完全分離，提取液中存在一定的水相，無法完全蒸干而且存在暴沸的風險。

4.3 試劑添加順序的探討

本研究在實施過程中，最佳的試劑添加順序為：乙腈、0.1mol/L乙酸銨、C18，上清液轉另一管后再加二氯甲烷。但對于像蝦這種非常粘稠的樣品，先用乙腈可能無法將其渦旋分散，因此可以先加0.1mol/L乙酸銨將其渦旋分散，再加乙腈，而C18必須在二者添加后才能加，否則會引起回收率偏低。其原因可能是一方面C18是一種非極性通用型吸附劑，對非極性物質具有比較好的吸附效果，MG類物質極性不大也可能被其吸附，另一方面MG類物質的PKa在6.5左右，在pH=4.5的乙酸銨緩沖液下，其已經充分離子化，從而不易被C18吸附，所以加入的順序必須注意。另外，二氯甲烷的加入必須將上清倒入另一管后再加，如果在同一管內加入，魚肉中的很多非極性物質會被萃取進來而帶來很大干擾，還可能造成分層困難（易乳化）。

5 結論

本研究建立的方法與國標法相比，具有如下優點：處理步驟簡單，檢測速度快；有機溶劑用量少，總共只用了15mL有機溶劑；檢測成本低，可只用C18散裝填料，不必使用價格昂貴的固相萃取小柱，成本大概為2元/樣品；檢測結果準確、可靠，經過本實驗室一年多來的實踐應用，獲得了比較理想的效果，值得推廣和應用。

［1］龐國芳，等.農藥獸藥殘留現代分析技術[M].北京：科學出版社，2007:488-489.

［2］GB/T 19857-2005 水產中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定[S].

［3］陳小華，汪群杰.固相萃取技術與應用[M].北京：科學出版社，2010:162.

［4］Waters Application Note.Optimized Extraction and Clear up Protocols for LC-MS/MS Multi-Residue Determination of Veterinary drugs in Edible Muscle Tissues.2011.

［5］S Lehotay.High-Throughput Screening Analysis by UPLC-MS/MS of 60 Veterinary Drugs in Animal Tissues[R].125thAOAC Annual Meeting Presentation 2303,21 September ,2011.