基于神經氨酸酶結構的流感病毒抑制劑的計算機輔助藥物設計

劉 磊，馬 英，王潤玲，王樹青，徐為人

（1.天津醫科大學藥學院，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津 300070；2.天津藥物研究院，天津市新藥設計與發現重點實驗室，天津 300193）

流感病毒是一種嚴重影響人類正常生活的流行性疾病，始終處于不間斷的變異中[1-3]。流感病毒表面蛋白神經氨酸酶（NA）在流感病毒生命過程中起著至關重要的作用，是抗流感病毒藥物設計的重要靶點。神經氨酸酶抑制劑類抗流感病毒藥物可同時抑制A、B 型流感病毒，不易引起抗藥性且耐受性好，神經氨酸酶抑制劑的發現是抗流感化學治療藥物研究中取得的重大突破性進展[4-6]。2006年Skehel 等對H5N1 流感病毒的N1 型神經氨酸酶三維結構解析成功并發現其與先前藥物設計的靶點N2和N9 型結構有很大的區別，其潛在的新配體結合空腔（150-cavity）為新型流感病毒藥物的設計提供更多的機會[7-9]。本研究旨在找到基于流感病毒表面蛋白NA 結構的新型抑制劑化合物，不僅靶向原來達菲占據的靶點，而且向新發現的150-cavity 伸展，使新型抑制劑更有利于抑制NA 的活性。

1 材料與方法

1.1 軟件及數據庫 DELL T5500 計算工作站，涉及軟件主要有Schrodinger 2009，Desmond2.4，在ChemBioOffice2010 上繪圖。受體來自PDB-Bank 數據庫，分子碎片庫是本實驗室手繪庫及已有碎片庫。

1.2 方法 虛擬藥物篩選也稱計算機篩選，即在進行生物活性篩選之前，在計算機上對化合物分子進行預篩選，以降低實際篩選化合物數目，同時提高先導化合物發現效率。

1.2.1 靶點選擇及活性位點分析 本文所用受體晶體結構是從PDB Bank 下載的，PDB ID為2HU0[10]。遵循以下條件：所選靶點晶體結構為人源的；晶體結構中氨基酸殘基沒有突變；晶體結構分辨率小于2.6魡。

1.2.2 靶點蛋白的優化 蛋白結構處理由Schrodinger Suite2009 軟件中的Protein preparation wizard 模塊完成。將下載的NA 靶點晶體結構（2HU0）導入Schrodinger Suite2009，首先對蛋白質結構進行修正，參數設定為Assign bond orders（修正化學鍵）；Add hydrogens（加氫）；Treat metals（處理金屬離子）；Cap termini by adding ACE&NMA residues（修正N 端和C 端的殘基結構錯誤），經處理后除去蛋白質晶體中的水分子和雜原子，只保留蛋白分子與原始配體。再對蛋白質結構進行優化，氫鍵優化參數為Sample water orientations，優化立場選擇OPLS_2005[11]，以RMSD0.5魡為收斂標準。

1.2.3 對接方法的驗證 在對小分子庫進行篩選之前，應驗證對接程序及所選參數是否適用于本研究。首先將原始配體OSE（達菲）從2HU0 靶點蛋白晶體復合物中剝離出來，再與原受體活性位點進行對接，如果對接后的配體結構能夠與原晶體中配體結構較好吻合，則表明該對接程序及所選參數適用于本研究的篩選。

1.2.4 配體準備 對Leadnow 分子庫中的分子進行配體優化處理，此步在LigPre 模塊中完成。小分子優化的力場為OPLS_2005，產生pH 值7.0±2.0 下的離子化狀態，去鹽，產生各種可能的互變異構體。

1.2.5 受體盒子生成 此步在Glid 模塊中完成，選擇Receptor Grid Generation。Site，按需要選擇,大小選擇10魡。

1.2.6 分子對接 分子對接利用Schrodinger Suite 2009 軟件中的Glide[12]模塊進行，以原始配體小分子為中心，自動生成對接盒子文件。對接精度為SP（標準精度），采用柔性對接，柔性對接時要求考慮各種環的柔性情況，要求對接函數在打分時對非平面型的酰胺鍵構象進行罰分，其它參數為默認值。虛擬篩選中對接精度為HTVS（高通量篩選）。

1.2.7 Core-Hopping Core-Hopping 模塊具有替換片段和分子對接兩大功能。在“Core Hopping”過程中，第一步是定義模板化合物。首先定義需要替換的片段，這一任務由Define Combinations step 完成。第二步需要定義受體盒子，這部分已在Receptor Grid Generation 中介紹。第三部分準備分子片段，分子片段來自于drug-like 數據庫和ZINC[13]數據庫中的片段數據庫。第四步把小分子片段連接到母核上，得到的結構對接到受體里。最后，依據對接得分進行篩選，得分的絕對值越大，親和力越強，結合力越好。

1.2.8 分子動力學 分子動力學模擬由Schrodinger Suite 2009 軟件中的Desmond2.4 模塊完成。使用SPC 水模型模擬人體內環境。為了使系統的密度維持恒定，采用周邊性邊界條件。為了得到電中性的環境，在蛋白質中加入0.15 mol/L 鈉離子和氯離子，離子在模型中自動排布。用Nose-Hoover 定溫計算法，調整平衡體系的溫度到300 K。用NPT 系綜保持體系溫度、壓強和原子數量不變，壓強為1 atm。最后進行系統能量最小化，用relax 去掉局部高能量，防止原子碰撞。3 ns 之后系統達到平衡，然后進行了10 ns 的模擬。

2 結果

2.1 高通量虛擬篩選，設計能夠進入150-cavity 的抑制劑 對Leadnow 數據庫中10 000個化合物進行篩選，選出和達菲與靶點結合力相似的1個化合物ZINC13219479。對此結構應用“Core Hopping”進行結構改造得出5個較好的結構,見表1。對接結果顯示：ZINC13219479 對接得分明顯高出Oseltamivir。從圖1（A）中可以看出ZINC13219479 不但與s 空腔結合良好，還與Arg118 形成p-π 共軛。由此，選ZINC13219479 作為進一步修改的候選化合物。開放式的150-loop 擁有較低的能量，所以可以嘗試設計出能夠占據150-cavity 的高效抑制劑。具體修飾過程如圖2 所示：在環上添加疏水分子片段以提高與受體的疏水臂的匹配性，找出8個優選片段R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8。對接結果顯示：分子結構與NA 具有較好的匹配性，羧酸頭上的羰基氧原子能與Arg118、Arg371 形成氫鍵，起到與Oseltamivir 的1-位羧酸類似的作用，還有咪唑環能與Arg118 形成p-π 共軛；通過-NHCO-伸入150-loop，使剛性環占據150-cavity 提高活性。圖1為ZINC13219479、comp#1 結合模式圖。選出得分最高的結構comp#1 進行動力學模擬，對對接結果做進一步驗證。

表1 對ZINC13219479 修飾結果Tab 1 The results of docking by Glide

2.2 動力學模擬結果 圖3 是NA 的空載蛋白及靶點與配體小分子復合物comp#1、Oseltamivir 的骨架原子RMSD 值隨時間變化圖?？梢钥闯?，空載蛋白在2 ns 左右達到了平衡，對于NA 與配體復合物體系在1 ns 左右達到了平衡。在達到平衡狀態后，NA 與配體復合物體系RMSD 較空蛋白時低，說明與配體結合后，NA 的柔性降低了，配體占住了靶點。

如圖3 所示，NA 的活性中心波動減少，說明設計的抑制劑與NA 的匹配程度很高。而新設計的抑制劑使150-cavity 區的波動減少，說明設計的抑制劑能抑制住150-cavity。

功能性保守殘基Asp151，其構象不會從“開放式”的形式變化為“封閉”的形式。因此，設計的化合物與Asp151 所及氧原子形成的氫鍵相互作用是一直很穩定的。為揭示這種機制，繪制了關鍵原子對的距離隨模擬時間變化的曲線。由圖4 可知，NAcomp#1 氨基上氫原子與Asp151 羧基氧原子間的距離均大約在0.15～0.25 nm 范圍內波動。說明穩定的氫鍵已經存在于配體和蛋白之間。

3 討論

3.1 NA 受體抑制劑的設計 S1為由3個精氨酸殘基組成的帶正電荷區域，能與抑制劑帶負電的取代基（如羧基）形成鹽橋。S2為由Glu227 和Glu119形成的帶負電的區域，能與抑制劑分子中的羧基、氨基或胍基以氫鍵的形式相互作用。S3為包括有Trp178 和Ile222 的側鏈形成的疏水性區域和與之相鄰的由Arg152 的側鏈形成的極性區域。抑制劑的羰基氧與Arg152 形成氫鍵，而甲基等疏水性基團與Trp178 和Ile222 形成的疏水區口袋作用。S4為由Ile222、Ala246 的側鏈和Arg224 的疏水面形成的較大的疏水口袋。S5為由Glu276 的羧基和Ala246 的甲基構成混合極性的區域，其中Glu276能與抑制劑側鏈的羥基形成氫鍵[14]。本文首先論證了所選擇NA（PDB ID∶2HU0）用作虛擬篩選的可行性。接著對Leadnow 數據庫的篩選得出優于達菲的小化合物ZINC13219479，對其改造找出能伸入150-cavity 的結構。分子結構與NA 具有較好的匹配性，羧酸頭上的羰基氧原子能與Arg118、Arg371 形成氫鍵，起到與達菲相似的作用；剛性環能與150-cavity空腔匹配，提高抑制作用。篩選得到化合物均能與NA 受體有較好的相互作用，具有潛在的抑制作用，因此可以作為針對NA 的抗病毒化合物。

3.2 NA 受體抑制劑分子動力學研究 結果顯示模擬過程中NA 與配體復合物體系是穩定的，結合位點是正確的。作為抑制劑，comp#1 類小分子配體與NA 的活性區域殘基形成穩定的氫鍵作用（如Arg118,292,371），牢牢占據NA 的催化位點，同時使S4、S5 區的殘基波動減小，從而抑制酶的活性；還可以伸入150-cavity 與150-loop 上的Asp151 和Arg118 形成氫鍵，阻止150-cavity 閉合。動力學模擬結果與分子對接結果一致。希望此設計理念和方法能為今后的研究奠定基礎。

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