膽固醇結石患者膽囊細菌的T-RFLP研究

葉吉云 李洱花 劉云霞 田大廣 高波★

2.昆明醫學院第二附屬醫院肝膽外科，云南，昆明 650101

末端限制性片段長度多態性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP）以分子生物學的手段，以微生物自身組成成分中的“家族特異性保守物質”（例如，DNA/RNA等）的分子進化史等為主要工作對象來研究微生物的群落生態[1]，對微生物的檢測不受微生物的狀態和培養手段的限制[2]，是目前被廣泛采用的DNA指紋印記分析的一種方法。在國內，對于分子微生物生態學的研究也是剛剛起步。本文為進一步探討細菌群落與膽囊結石的發病機理之間的關系，采用T-RFLP技術對膽囊結石微生物群落16S rDNA基因序列進行分析研究。

1 資料與方法

1.1 標本來源

取自2007年2月～2007年6月在昆明醫學院第二附屬醫院接受擇期膽囊切除術的膽囊結石患者，術前3個月內無急性膽道感染癥狀，HBsAg陰性。完成腹腔鏡膽囊切除術，無菌注射器穿刺取膽汁3 mL～5 mL置于無菌試管內，同時收集膽囊結石，記錄其大小、數目，用生理鹽水沖洗干凈。標本放在無菌容器內-20℃保存。依據紅外吸收光譜法測定膽固醇含量純膽固醇結石（CS）：膽固醇含量≥90%，納入本研究。膽汁細菌常規和厭氧培養陽性的病例被剔除。本組8例中男3例，女5例，年齡25～73歲，平均年齡55歲。診斷經病理證實。

1.2 微生物群落DNA 提取方法

1.2.1 結石微生物群落DNA提取

干燥至恒重后取150 mg結石粉末，加入 1% SDS 700μL在5 mL聚丙烯試管內，室溫培養過夜。加入LiCl（7 mol/L），最終濃度為1.5 mol/L。靜置15 min，震蕩 1 min，離心（12 000 rpm，15 min）；取上清液至一滅菌塑料離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇混合液抽提2次，取上清液，加1/10體積3 mol/L醋酸鈉。再加無水乙醇（終體積比80%），-70℃靜置2 h，將上部所得溶液全部倒入收集管內的吸附柱中，12 000 rpm離心5 min，將柱放入干凈EP管中，加30～50μL TE緩沖溶液（含RNA酶）充分溶解DNA。靜置1 min，12 000 rpm離心2 min，洗脫液為提取到的DNA，-20℃保存。

1.2.2 膽汁微生物群落DNA提取

對文獻[3]介紹的DNA 提取方法進行適當修改后作為本研究的DNA 提取方法。取膽汁混合樣10 mL，用聚碳酸酯膜（0.22μm，47 mm，北京華美公司）進行真空抽濾（-0.1 MPa），待水樣抽干后，將濾膜取下，用無菌剪刀剪成小塊，放入10 mL無菌離心管；加入1 mL Buffer I（0.15 mol/L NaCl，0.1 mol/L Na2EDTA，pH8），渦旋振蕩，使buffer I與膜充分接觸；加入100μL溶菌酶（50 g/L），溫育1 h（37℃）；將離心管放入液氮中5 min 后迅速移至65℃水浴鍋中解凍3 min，這樣反復凍融3次；加入0.5 mL buffer II（0.1 mol/L NaCl，0.5 mol/L Tris-HCl，10%SDS，pH8），上下搖勻，加入5μL蛋白酶K（20 g/L），水浴1 h（55℃）；依據標準方法[4]進行酚仿抽提2次，取上清轉移至新的10 mL離心管中；加入2倍體積無水冰乙醇沉淀DNA，-20℃過夜，離心（13 000 rpm，30 min）；棄去上清，加入1 mL 70%乙醇，離心（13 000 rpm，15 min），棄上清；干燥后，加入30～50μL TE 緩沖溶液充分溶解DNA。

1.3 膽汁、結石細菌16S rDNA 基因擴增

對樣品DNA進行適當稀釋之后，進行細菌的16S rDNA的PCR擴增。擴增體系總體積50μL：（1）10×buffer：5μL；（2） 4×dNTP：4μL（2.5 mM）；（3）MgCl2：3μL（25 mM）；（4）8F-FAM：1μL（10 pmol/μL）；（5）1492R：1μL（10 pmol/μL）；（6）Taq 酶：0.3μL（TaKaRa，5 U/μL）；（7）滅菌水：33.7μL；（8）DNA模板：2μL。熱循環條件預變性：94℃，5 min；變性：94℃，1 min；退火：51℃，1 min；延伸：72℃，1.5 min；30個循環；4℃保存PCR產物。細菌的擴增引物采用細菌通用引物8F（5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'）和 1492R（5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'），在引物8F的5'端標記熒光物質（6-FAM）。用于構建克隆文庫的PCR則采用不帶熒光標記的引物。PCR產物利用ChargeSwitch純化試劑盒（Invitrogen，USA）進行純化。

1.4 T-RFLP分析

對細菌16S rDNA的PCR純化產物分別用TaqI、65℃酶切 3 h 和 RsaI、37℃酶切 3 h；酶切產物進行脫鹽后[5]，用甲酰胺進行溶解；取3～5 μL酶切產物至10μL甲酰胺中，并加入0.2μL 內標Liz500（Applied Biosystems Incorporated，USA）；將該混合物在95℃變性5 min，然后迅速轉移至冰上，取10μL至96孔板中，在ABI 3130遺傳分析儀中進行毛細管電泳；取熒光強度50RFU為基線，用Genemapper軟件（Applied Biosystems Incorporated，USA）計算大于基線的峰高和出峰處的末端標記限制性片段（Terminal Restriction Fragment，T-RF）長度；將T-RF大于50 bp的峰面積進行標準化處理[6]，計算相對應的豐度。

1.5 克隆文庫的構建、測序和系統發育分析

利用非熒光標記的引物對細菌的16S rDNA片段進行PCR擴增，采用pGEM-T easy載體（Promega，USA）和E.coli DH5α菌株建立細菌的16S rDNA文庫。利用PCR-T-RFLP分析對細菌克隆文庫中隨機挑選的46個陽性克隆進行分型篩選，挑選代表克隆進行測序（北方諾塞基因公司），獲得細菌的16S rDNA部分序列。對這些序列利用Blast分析與GenBank中核酸數據進行序列比對（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）。

2 結果

2.1 膽汁、結石微生物群落DNA檢出率

膽汁標本均未提取到膽汁細菌總DNA。結石標本中，純膽固醇組細菌16S rDNA陽性率為37.5%（3/8）。

2.2 純膽固醇組膽囊結石T-RFLP圖譜分析

純膽固醇組中有3例標本經PCR獲得細菌16S rDNA，分別標為 L1、L2、L3通過對其在 ABI 3130遺傳分析儀中進行毛細管電泳，用Genemapper軟件計算大于基線的峰高和出峰處的T-RF長度得到T-RFLP 圖譜（圖 1、2、3）。

根據T-RF不同，挑選相應的克隆測序，結果表明，純膽固醇結石中細菌主要為Enterobacteriaceae和Mircrococcaceae的微生物，其中克隆D13、D12、E13（T-RF 422 bp）分 布 在Enterobacteriaceae的Escherichia屬，T-RF同為422 bp的E9則分布在Enterobacteriaceae的Salmonella屬；克隆F4（T-RF 394 bp）為Enterobacteriaceae的Klebsiella屬，克隆D10、G7、D8（T-RF 394 bp）則分布在Mircrococcaceae的Staphylococcus屬。

T-RF同為422 bp的D15克隆則可能是屬于新的微生物物種，因為目前在Genebank中尚未找到與其16S rDNA序列相似的細菌序列。（表1）。

圖1 樣品L1的細菌群落T-RFLP圖譜Figure 1 T-RFLP diagram of sample L1

圖2 樣品L2的細菌群落T-RFLP圖譜Figure 2 T-RFLP diagram of sample L2

圖3 樣品L3的細菌群落T-RFLP圖譜Figure 3 T-RFLP diagram of sample L3

表1 純膽固醇結石中主要優勢T-RF細菌克隆序列比對結果Table 1 Comparison of the clone seguence of T-RF bacteria in cholesterol stone

3 討論

1995年Swidsinski[7]用NT-PCR方法，發現在常規細菌培養陰性的膽固醇結石中有較高的細菌DNA檢出率，才將細菌感染引入到膽囊結石的研究中，由于方法學的限制，人們對引起膽囊結石的微生物認識有限，特別是對膽固醇含量超過90%的純膽固醇結石與細菌感染的關系更是知之甚少。

分子微生物生態學就是運用分子生物學的方法和技術，在基因水平上估計種的個體豐度，查明種的變異情況以及探究群落中微生物間相互關系的科學。生物技術的應用，使我們不必培養微生物，而直接通過對環境中遺傳物質的研究來達到目的，它為微生物生態學的研究開辟了新的途徑，T-RFLP又被稱為16S rDNA 基因的 T-RF分析技術，是一種新興研究微生物多態性的分子生物學技術。該技術已被成功地應用到了各種微生物群落的比較分析、微生物群落多樣性及結構特征等方面。T-RFLP是根據16S rDNA的保守區設計通用引物，對上游引物的5'端用熒光物質6-FAM標記，然后選擇適當的限制性內切酶消化，再經毛細管電泳就可建立各細菌菌株特有的峰譜。本法能夠檢測難以培養的各種細菌。由于只有5'末端有標記，因此用GeneScan基因掃描儀只能測定5'末端帶有熒光標記的限制性片段，從而克服了產生大量酶切片段的問題。利用T-RFLP方法分析16S rDNA片斷中高度保守的家族特異性序列的種類、數量和相對豐度就可以了解樣品中各種微生物的種類，種群數量和相對組成，從而比較準確、全面和客觀地了解該環境中微生物群落的組成。其主要優勢不僅避免了傳統微生物富集培養的高度選擇性、繁雜費時等限制，還可以同時進行多個樣品的并行分析，速度快，信息量大，而且準確全面，易于實現自動化及互聯網海量數據共享，從而探明微生物生態系統的功能和微生物群落結構的變化，有助于疾病分析及治療。

本研究以利用T-RFLP技術對純膽固醇結石細菌微生物群落16S rDNA基因序列進行分析，研究表明在膽汁中并未發現細菌16S rDNA存在的證據，而在結石中卻有豐富的細菌16S rDNA。根據既往研究結果，我們認為即使膽汁中能夠發現細菌16S rDNA存在的證據也僅能反映膽囊切除時細菌感染的情況，而結石中的細菌檢出率則反映的是結石形成和生長過程中細菌感染的狀況，二者在時間上無可比性。本研究也顯示，在膽汁中無細菌16S rDNA存在的樣本中，結石卻能發現細菌16S rDNA，二者并無明顯的聯系。

研究表明純膽固醇結石細菌16S rDNA陽性率為37.5%（3/8），T-RF主要為394 bp和422 bp。經克隆測序表明，細菌群落主要為腸桿菌（Enterobacteriaceae）和微球菌科（Mircrococcaceae）的微生物，這與已知的腸道菌群有較高的相似性，由此推斷定植于腸道的正常菌群或條件致病菌細菌在某種因素的影響下可以突破機體的防御系統通過Oddi氏括約肌進入膽道到達膽囊定植，通過細菌本身和/或其代謝產物參與膽囊結石的形成。細菌群落在屬水平涉及埃希氏菌屬（Escherichia），沙門氏菌屬（Salmonella），克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和葡萄球菌屬（Staphlococcus），這些微生物群落在較高的分類學水平（例如科）的群落多樣性并不很高，而在屬水平表現出了不同的多樣性，可能是由于膽囊對膽汁的濃縮功能，膽汁中含有一些物質，如膽汁酸鹽、膽固醇和微量元素，可作為電子受體或營養物質支持細菌生長代謝，并使結石細菌群落表現出多樣性。同時也應看出，有一定的未培養微生物（Uncultured bacterium clone）檢出其多樣性尚未納入研究，對這類目前尚未培養的未知細菌的功能特性和生命活動規律的了解、還需更加深入的研究。

特別指出在本研究中檢測到腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的沙門氏菌屬（Salmonella）。在體外研究發現，Salmonella能夠形成生物被膜，抵御膽鹽的侵襲，通過生物被膜與其他定植于膽囊的細菌相連接，共同構成一個相對穩定的細菌群落，將其生物被膜不斷擴展以保護整個群落不受外界物質侵襲，而膽汁恰恰是生物被膜形成的最佳刺激信號。同時發現，Salmonella首先要在結石表面定植才能形成被膜，而且成膜時間平均為10～14天，而其他能夠成膜的細菌平均成膜時間為幾秒鐘至幾小時不等。但在體內由于膽囊內環境極為復雜，膽囊的排空功能在體外難以模擬，Salmonella能否也能形成生物被膜有待證實。

T-RFLP也有一定的局限性：（1）T-RFLP 是基于PCR 擴增的技術，因此就擺脫不了這類技術共同的缺陷；（2）該指紋印記技術只檢測帶熒光標記的末端限制性片段，造成對群落多樣性的低估；（3）酶切后T-RF 的長度分布也會造成對復雜群落多樣性的低估。因為測序儀檢測500 bp以上的T-RF精度不夠[8]；（4）實驗過程影響因素眾多，使得T-RFLP圖譜的解析存在一定的不確定性。比如DNA提取方法、PCR中的參數設置及限制性內切酶等的選擇都可能直接對最終的T-RFLP圖譜產生影響。本研究僅為初步探討，具體細節還有待進行更廣泛而深入的研究。

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