類風濕性關節炎患者血清GM-CSF、IL-6、IL-17和TNF-α的水平測定及臨床意義

湯榮華， 黃建軍

(皖南醫學院弋磯山醫院檢驗科，安徽蕪湖 241001)

類風濕性關節炎(RA)是一種以累及周圍關節為主的多系統性炎癥性自身免疫性疾病，其典型癥狀為對稱性、多個周圍性關節的慢性炎癥病變，病變呈持續、反復發作的過程，其病理為滑膜炎，侵襲下層關節軟骨及骨，造成關節破壞。RA的病因和病理機制尚未完全闡明，多種源自免疫系統和滑膜組織的細胞及其分泌的細胞因子參與了疾病的發展。近來有文獻報道，炎癥因子網絡持續的激活/調節異常與自身抗原刺激的免疫反應一起，成為RA患者關節慢性炎癥持續存在的主要因素［1-4］。鑒于細胞因子網絡在RA患者關節慢性炎癥反應中的關鍵作用，外周循環血或關節液中的細胞因子可能成為監控病情發展和判斷預后的良好指標。本研究立足于RA慢性炎癥的最新報道，檢測中性粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素17(IL-17)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)在RA患者外周血中的水平，評價這些細胞因子與RA病情發展的相關性。

材料和方法

一、研究對象

活動期RA患者45例，其中男14例，女31例，年齡(51.5±5.62)歲;穩定期 RA 患者36例，其中男9 例，女27 例，年齡(49.6±7.52)歲;健康對照組50名，為正常體檢健康者，性別、年齡與患者組相匹配。RA患者活動判斷標準:(1)關節腫脹≥6個;(2)關節壓痛≥6個;(3)晨僵≥45 min;(4)紅細胞沉降率(ESR)≥40 mm/h;(5)C反應蛋白(CRP)＞15 mg/L。RA患者存在(1)+(2)同時伴有(3)、(4)、(5)3項的任何2項被認為活動;不同時滿足(1)+(2)或(3)、(4)、(5)僅1項被認為不活動或活動度低。

二、方法

GM-CSF、IL-6、IL-17 和TNF-α的檢測采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，GM-CSF、IL-6、IL-17 和TNF-α試劑盒均由美國RB公司提供，操作步驟嚴格按照說明書進行。應用Bio-RAD酶標儀測量450 nm處吸光度(A)值，并將其在標準曲線下換算成濃度值。CRP采用免疫比濁法檢測。

RA患者病情活動度的評估采用ESR式疾病活性分數 28(DAS28)，DAS28=［0.56×sqrt(T28)+0.28×sqrt(SW28)+0.7×Ln(ESR)］×1.08+0.16，數值范圍為0～10。其中，T28 表示雙側近端指間關節、掌指關節、腕關節、肘關節、肩關節及膝關節共計28個關節觸痛或被動活動時的觸痛數;SW28表示上述28個關節的腫脹數。

三、統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件包進行數據處理，由于原始數據呈輕度偏態分布，計量資料用中位數(四分位數間距)表示，對每個值進行換，轉換后按正態分布數據處理，采用±s表示。各組間均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)或 t檢驗，多重比較采用Bonforroni檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、CRP、ESR水平及DAS28比較

CRP、ESR水平和DAS28在研究對象間的比較見表1，活動期RA患者組3項指標均顯著高于靜止期RA患者及健康對照組(P＜0.05)。

表1 CRP、ESR和DAS28在研究對象間的比較

二、研究對象血清GM-CSF、IL-6、IL-17 和TNF-α水平的比較

活動期 RA患者血清中GM-CSF、IL-6和TNF-α的水平顯著高于靜止期RA患者和健康對照組(P＜0.01);靜止期 RA患者血清中GMCSF、IL-6和TNF-α的水平顯著高于健康對照組(P＜0.05)，IL-17在3組間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

三、4種細胞因子及DAS28的相關性分析

4種細胞因子均有顯著的正相關性，其中GMCSF與TNF-α和IL-6的相關系數較高，與IL-17的相關系數較低，DAS28與TNF-α、IL-6和GM-CSF均有顯著的相關性。見表3。

表2 3組血清GM-CSF、IL-6、IL-17和TNF-α水平的比較 (pg/mL)

表3 4種細胞因子及DAS28在研究對象間的相關性分析 ［r值(P值)］

討 論

本研究比較巨噬細胞源性細胞因子(GMCSF、IL-6和TNF-α)和Th17細胞源性細胞因子(IL-17)在靜止期和活動期RA患者體內的水平，分析4種細胞因子之間的相互關系及其與RA患者疾病活動度之間的關系。GM-CSF、IL-6和TNF-α在活動期RA患者外周血中的濃度均顯著高于靜止期RA患者和健康對照者，而IL-17在3組間差異無統計學意義，表明單核-巨噬細胞系統在RA患者慢性關節炎的持續發作中發揮重要作用，而 Th17細胞在病情的維持中可能無明顯作用。

GM-CSF是由內皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞和活化的T細胞在細菌脂多糖(LPS)、白細胞介素1(IL-1)和TNF-α等炎癥因子的刺激下分泌的一種細胞因子，最初認為GM-CSF促進骨髓前體細胞增殖分化為巨噬細胞、粒細胞和樹突狀細胞(DC)［5-7］。近來的研究表明，GM-CSF 調節巨噬細胞的多種功能，包括細胞黏附、病原模式識別受體的表達、促進炎癥因子［白細胞介素12(IL-12)、白細胞介素 18(IL-18)、IL-6 和TNF-α)］的分泌以及吞噬和殺滅病原體。GM-CSF對于自身免疫性疾病的產生具有重要的作用，GM-CSF基因敲除的骨髓細胞發育分化良好，不易發展成為實驗性變應性腦炎、膠原誘導的關節炎以及實驗性自身免疫性心肌炎，GM-CSF抗體能夠避免或緩解動物自身免疫性炎癥的發生［8-11］。RA患者關節滑膜液和血漿中GM-CSF及其受體濃度升高，滑膜組織細胞、軟骨細胞、外周血單個核細胞胞內GM-CSF受體過度表達［12］，表明 GM-CSF在RA慢性關節炎中具有重要作用。有文獻報道，GM-CSF能夠緩解Felty's綜合征以及化療引起的粒細胞減少，同時卻促進了關節炎的復發。本研究發現，GM-CSF在活動期RA患者外周血中的水平為27.4(34.8)pg/mL，顯著高于靜止期 RA 患者［12.7(9.7)pg/mL］和健康對照者［6.2(5.2)pg/mL］;靜止期RA患者的GM-CSF濃度也高于健康對照者，表明GM-CSF可能是促進并維持RA關節滑膜炎的重要細胞因子，隨著GM-CSM濃度的增加，RA患者關節炎呈現活躍狀態。我們同時發現IL-6和TNF-α在RA患者外周血中的水平顯著高于健康對照組，活動期RA患者顯著高于靜止期RA患者，表明細胞因子網絡在RA關節炎活動期處于激活狀態，巨噬細胞活化并分泌相關細胞因子，促進關節炎癥的反復發作。聯合檢測血清中GM-CSF、IL-6和TNF-α的水平有助于RA患者病情活動度的監測。

IL-17是Th17細胞分泌的主要細胞因子，IL-17可通過誘導其他細胞因子、蛋白酶和黏附分子的產生發揮其在RA中的作用。IL-17通過核轉錄因子κB(NF-κB)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)等細胞通路來促進多種細胞因子分泌，包括IL-6、IL-8 及 TNF-α等［13-14］;同時IL-17能夠誘導中性粒細胞產生和成熟。IL-17單獨或與IL-1β/TNF-α等協同刺激關節滑膜細胞表達IL-6，這些細胞因子募集炎性細胞，使巨噬細胞、中性粒細胞、幼稚DC細胞和T細胞等在關節滑膜處聚集，增強炎癥反應，加快滑膜細胞增殖［15-16］;而且IL-17能誘導巨噬細胞分泌基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-3、MMP-9 及MMP-13［17］，促進軟骨蛋白多糖及膠原降解，增強單核巨噬細胞對軟骨基質的破壞［18-19］。IL-17可以通過上述多種途徑誘導關節的破壞，然而本研究表明，IL-17在活動期和靜止期RA患者外周血中的濃度分別為23.4(19.5)和19.3(16.4)pg/mL，差異無統計學意義，與健康對照組的濃度20.8(16.1)pg/mL相比差異亦無統計學意義，提示IL-17在RA誘導期和發病期作用是不同的，IL-17可能僅參與RA誘發，與RA關節滑膜炎的反復發作可能無明顯關聯。IL-17在慢性關節滑膜炎癥維持中的作用還有待闡明［20］。

我們同時對RA患者血清中4種細胞因子間以及與DAS28分數的相關性進行分析，發現4種因子間均呈正相關關系，其中GM-CSF與TNF-α和IL-6的相關系數最高(r=0.738、0.637)，與IL-17的相關系數較低(r=0.171);GM-CSF與DAS28也具有較強的相關性(r=0.583)，表明GM-CSF與RA疾病活動度有密切關聯。這種相關性提示GM-CSF可能是炎癥因子網絡中的核心調控者。T細胞識別關節組織特異性抗原，誘發炎癥，分泌 GM-CSF等細胞因子［21］，在關節滑膜炎中，GM-CSF募集骨髓中的單核細胞和粒細胞，在關節處發育分化，分泌大量 TNF-α和IL-6，促進關節炎癥的發展;而在靜止期，RA患者GMCSF的濃度降低，募集的單核細胞和粒細胞減少，分泌的TNF-α和IL-6也隨之降低，關節炎癥呈現恢復趨勢。

總之我們的研究表明，細胞因子網絡是維持和促進RA關節滑膜炎的重要因素，GM-CSF、IL-6及TNF-α的水平有助于判斷RA的活動度;GMCSF與疾病活動度及血清中IL-6和TNF-α的水平均呈正相關，可能是RA患者細胞因子網絡的重要調控者，GM-CSF在RA發病過程中的作用有待深入研究。

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