劉新濤,吳叢梅,臧 陽,孫 博,殷玉和
(1.長春工業大學 化學與生命科學學院,長春 130012;2.吉林大學 生命科學學院,長春 130012)
DNA疫苗是指直接向宿主體內免疫能編碼病原體有效抗原的質粒,相應抗原在體內進行表達后便誘導機體產生特異性抗體,并引起細胞免疫反應而獲得保護力[1-4].與傳統疫苗相比,DNA疫苗能夠誘導廣泛的免疫反應[5-6].由于質粒DNA的轉染效率較低,臨床應用中需要毫克級的質粒DNA,因此DNA疫苗必須達到克級以上的生產規模以滿足需要.本文建立了HIV-GAG藥用級質粒DNA疫苗規?;a工藝,通過使用高鹽沉淀RNA、 中空纖維超濾濃縮、 離子交換介質和復合模式凝膠過濾介質,對質粒DNA純化,去除RNA、 染色體DNA、 宿主蛋白質和內毒素等雜質,獲得了高純度的質粒DNA.其工藝流程如圖1所示.
圖1 藥用級HIV-GAG質粒DNA疫苗工藝流程
Fig.1 Process flow sheet describing purification of HIV-GAG DNA
含有HIV核心抗原質粒的大腸桿菌菌株DH5α由吉林大學生命科學學院艾滋病疫苗國家工程實驗室提供.質粒大小為6.4 kb.CaptoTMcore 700和CaptoTMDEAE購于美國GE(GE Healthcare Life Science)公司.
E.coliDH5α菌種和LB培養基經搖瓶擴增培養后,轉接到生物反應器中于37 ℃培養,通過攪拌速度和補料速度控制溶氧量,收獲的細菌經離心后于-20 ℃保存.
取200 g大腸桿菌DH5α發酵菌體,加入1.6 L預冷溶液Ⅰ(50 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L EDTA,pH=8.0)中,攪拌混勻后,加入1.6 L溶液Ⅱ(0.2 mol/L NaOH,質量分數為1.0%的十二烷基硫酸鈉(SDS)),緩慢攪拌10 min; 再加入1.6 L預冷溶液Ⅲ(3 mol/L KAc,pH=5.5),形成白色絮狀沉淀物,反應30 min,最后加入2.0 mol/L的CaCl2溶液1.6 L,搖勻,靜置1 h,溶液分為兩層,其中上層為白色絮狀物,下層為裂解液,將下層裂解液用蠕動泵導出并用1.0 μm孔徑的濾芯過濾除雜.
將裂解液通過Quickstand超濾分離系統用分子量為300 000的中空纖維超濾膜(美國GE Healthcare Life Science公司,膜面積850 cm2,膜纖維管直徑1 mm)過濾.經6.895 kPa膜負壓(TMP)1.5 h后,濃縮體積為200 mL,用注射用水將其稀釋5倍.
將CaptoTMcore 700純化后樣品通過Quickstand超濾分離系統用分子量為300 000的中空纖維超濾膜(美國GE Healthcare Life Science公司,膜面積140 cm2,膜纖維管直徑1 mm)過濾.經6.895 kPa膜負壓1 h.
用MicroBCA試劑盒(美國Pierce公司)測定HIV-GAG DNA疫苗中的蛋白質量比.反應體系中的混合物(100 μL HIV-GAG DNA疫苗樣品,100 μL micro-BCA試劑)在60 ℃水浴鍋中孵育30 min,在λ=562 nm下檢測蛋白的吸收值.
用Southern blot方法[7]檢測基因組DNA污染.通過PCR方法擴增大腸桿菌DH 5α菌株16S RNA的361 bp片段(正向引物:5′-ACACGGTCCAGACTCCTACG-3′;反向引物:5′-TACACCTGGAATTCTACCCC-3′),用Digoxigenin-11-dUTP(美國Boehringer Mannheim公司)標記; 用堿性磷酸酶標記的地高辛對雜交探針進行免疫檢測,通過堿性磷酸酶底物顯色(NBT/BCIP)進行觀察.用鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司)凝膠法檢測內毒素.
細菌按1∶8分別加入溶液Ⅰ~Ⅲ和2.0 mol/L CaCl2進行菌體裂解,裂解液經過濾除雜后,通過Quickstand超濾系統用分子量為300 000的中空纖維超濾膜進行超濾濃縮.
裂解濃縮液經注射用水稀釋至電導值為合理數值的濃度.圖2為CaptoTMDEAE純化質粒DNA疫苗的色譜,其中峰1~ 峰3分別為緩沖液B洗脫RNA、 緩沖液C洗脫質粒DNA及CIP洗脫基因組DNA.各洗脫樣品的瓊脂糖凝膠電泳譜如圖3所示.由圖3可見,當加入高鹽氯化鈣時,去除了大部分RNA雜質; 裂解濃縮液經CaptoTMDEAE純化后,質粒濃度明顯提高,但仍存在少量RNA.
圖2 CaptoTM DEAE純化HIV-GAG DNA疫苗色譜Fig.2 CaptoTM DEAE purification of HIV-GAG DNA vaccine
1: 堿裂解未加CaCl2樣品;2: 堿裂解加CaCl2后樣品;3: 流穿峰樣品;4: 溶液B洗脫峰樣品;5: 溶液C洗脫峰樣品;6: CIP溶液洗脫峰樣品;7: 水洗脫峰樣品;8: 1 kb DNA Ladder.圖3 CaptoTM DEAE純化HIV-GAG DNA 疫苗瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.3 Agarose gel electrophoresisanalysis of CaptoTM DEAE purification of HIV-GAG DNA vaccine
用CaptoTMcore 700進一步純化質粒DNA,其色譜如圖4所示,其中峰1為質粒DNA峰,峰2為CIP溶液洗脫下來的雜質峰.圖5為經CaptoTMcore 700進一步純化獲得高純度質粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜.經超濾濃縮和無菌過濾,質粒DNA質量濃度達1.0 mg/mL.
圖4 CaptoTM core 700純化圖譜Fig.4 CaptoTM core 700 purification of HIV-DNA vaccine
1: CaptoTM core 700純化樣品;2: 1 kb DNA Ladder.圖5 CaptoTM core 700純化HIV-GAG DNA 疫苗瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.5 Agarose gel electrophoresisanalysis of CaptoTM core 700 purification of HIV-GAG DNA vaccine
HIV-GAG質粒DNA疫苗經過檢測,符合《中華人民共和國藥典》[8]相關規程,檢測結果列于表1.由表1可見,制備的HIV-GAG質粒DNA疫苗的基因組DNA質量比低于1 μg/mg,蛋白質質量比低于2 μg/mg,內毒素質量比低于10 EU/mg,用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測表明無RNA殘留.
大規模生產DNA疫苗過程中的一個關鍵環節是菌體裂解步驟,本文采用改良后的堿裂解方法[9]破碎大腸桿菌,提高了裂解效率.加入溶液Ⅱ后應緩慢攪拌,避免局部pH值過高,過高的pH環境可使質粒DNA變性并破壞基因組DNA,導致不易分離質粒DNA(pH>12.5)[10].Urthaler等[11]研制的自動堿裂解裝置能夠溫和地堿裂解大腸桿菌細胞,從而獲得均一且穩定的質粒DNA,并能避免極端pH值的影響.本文利用低剪切槳葉攪拌也能解決該問題,裂解后向裂解液中加入高濃度的CaCl2溶液,可沉淀大部分高分子量的RNA及宿主蛋白.因此在大規模生產過程中,既可在離子交換層析前調整離子強度除去RNA[12],也可采用分子篩層析法分離RNA和DNA[13].本文采用高鹽沉淀高分子量RNA和超濾去除低分子量RNA的方法,可除去RNA、 大多數蛋白質、 內毒素及基因組DNA,提高了質粒DNA的純化效率.并采用CaptoTMcore 700凝膠介質用于純化HIV-GAG質粒DNA疫苗.
表1 HIV-DNA疫苗質量檢測結果Table 1 HIV-DNA vaccine quality test
綜上,本文通過堿裂解的方法破碎菌體,采用超濾濃縮的方法將裂解液濃縮,通過離子交換介質和復合模式凝膠過濾介質進行純化獲得了HIV-GAG藥用級質粒DNA疫苗.
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