葡萄酒泥酵母超氧化物歧化酶分離提取工藝條件優化

杜 娜，楊學山，韓舜愈，祝 霞，付文力，王 婧，盛文軍，張 波

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070;2.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅蘭州730070)

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD，EC1，15，1，1)是廣泛存在于生物體內的一種胞內金屬酶，可催化超氧陰離子(superoxideanions，O2－·)與H+發生歧化反應，解除O2－·對機體的毒害［1］。因此，SOD制劑已被廣泛應用于醫療、食品及化妝品領域［2］。自1969年 Mccord從牛血中發現SOD以來，人們已從豬、牛、馬等動物紅細胞、肌肉、肝臟組織以及植物和微生物中分離化出SOD，其中利用微生物生產SOD具有成本低、周期短、適用于規?；a和所得產品安全性高等特點［3－6］。研究證實，真核微生物的SOD含量一般高于原核微生物，其中酵母菌含有豐富的線粒體，呼吸系統最完整，因而SOD含量高于其它絲狀真菌，可以作為 SOD的主要生產菌種［7－8］。葡萄酒泥是葡萄酒釀造過程中的主要副產物，含有大量的酵母細胞［9］。據統計，2011年我國葡萄酒年產量已達123.2萬t，加工各個階段產生酒泥量約占總加工量的4%～5%［10］。但目前國內葡萄酒泥酵母尚未得到充分利用，大多數企業將其作為飼料、肥料，附加值很低，有一些甚至作為垃圾傾倒，不僅污染環境，而且浪費了寶貴的生物資源［11］。因此，利用葡萄酒泥酵母生產SOD，有較大的經濟意義和社會意義。酵母具有較為堅固的細胞壁，破壁效果直接影響SOD的分離提取。蘇昕等［12］研究了發酵培養Y12酵母菌分離制備酵母SOD，并對其部分酶學性質進行了深入的探討;廖湘萍等［13］采用異丙醇破壁法對啤酒酒泥酵母生產SOD進行了研究;王歲樓等［14］采用甲苯破壁法從活性干酵母中直接提取SOD，但利用葡萄酒泥酵母純化SOD尚未見報道。甲苯可溶解酵母細胞膜磷脂層，改變細胞膜結構，提高細胞膜的通透性，從而使胞內物質釋放使［15］。因此，本實驗以葡萄酒泥酵母為原料，采用效果較好的甲苯法對酵母細胞進行破壁，并通過正交實驗優化提取工藝參數，以期建立較為高效的技術路線，為葡萄酒泥酵母的資源化利用提供一定的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄酒酵母泥 甘肅祁連葡萄酒業有限公司;牛血清白蛋白 pharmacia公司;SOD活性測定試劑盒 南京建成生物工程有限公司;甲苯、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、EDTA、檸檬酸、Na2HPO4－12H2O、考馬斯亮藍等常規試劑均為國產分析純。

SL－1001電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司;TDZ5－WS離心機 湖南儀離心機儀器有限公司;HH－6數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;PHS－3C pH計 上海雷磁有限公司;808型紫外－可見分光光度計 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄酒泥酵母SOD提取技術路線 葡萄酒泥→預處理→收集濕酵母→加入甲苯→熱處理→加入磷酸鹽緩沖液→室溫浸提→離心→熱變性→離心→提取液→SOD活性及蛋白質含量測定。

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 葡萄酒泥酵母預處理 將葡萄酒酒泥與蒸餾水以1∶1混合，用80目篩篩分，4000r/min離心20min。重復上述步驟，直至所得沉淀為白色，上清液無色透明為止，收集沉淀備用。

1.2.2.2 甲苯破壁 1g濕酵母中加入0.8mL的甲苯溶液，35℃保溫 45min后，加入 pH7.8、0.05mol/L的磷酸緩沖液(含0.1mmol/L EDTA)3mL，室溫浸提5h，4000r/min離心15min，收集上清液。

1.2.2.3 熱變性 收集的上清液置于55℃水浴鍋中熱處理15min，4000r/min離心15min，除去雜蛋白，即得SOD酶液。取樣進行SOD活性及蛋白質含量測定。

1.2.3 單因素實驗設計

1.2.3.1 甲苯用量對SOD提取的影響 稱取5份各2g 濕酵母細胞，分別加入0.8、1.6、2.4、3.2、4mL 甲苯，35℃保溫處理45min，加入0.05mol/L、pH7.8磷酸鹽緩沖液6mL，攪拌均勻后在室溫條件下浸提5h，離心、熱變性去除雜蛋白。測定SOD活性及蛋白質含量。

1.2.3.2 甲苯作用時間對SOD提取的影響 稱取5份各2g濕酵母細胞，加入0.8mL甲苯，35℃條件下分別處理 15、25、35、45、55min，加入 0.05mol/L、pH7.8磷酸鹽緩沖液6mL，攪拌均勻后在室溫條件下浸提5h，離心、熱變性去除雜蛋白。測定酶活性及蛋白質含量。

1.2.3.3 甲苯作用溫度對SOD提取的影響 稱取5份各2g濕酵母細胞，加入0.8mL的甲苯，分別在30、35、40、45、50℃ 保溫處理 35min 后，加入 pH7.8、0.05mol/L磷酸鹽緩沖液6mL，攪拌均勻在室溫條件下浸提5h，離心、熱變性去除雜蛋白。測定酶活性及蛋白質含量。

1.2.3.4 磷酸緩沖液pH對SOD提取的影響 稱取5份各2g濕酵母細胞，分別加入甲苯0.8mL，45℃保溫處理 35min，依次加入 pH7.2、7.4、7.6、7.8、8.0 的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液6mL，攪拌均勻后在室溫條件下浸提5h，離心、熱變性去除雜蛋白。測定SOD活性及蛋白質含量。

1.2.4 正交實

驗優化 根據單因素實驗結果確定葡萄酒泥酵母中提取SOD的正交實驗因素和水平，采用L9(34)正交實驗設計，優化SOD提取工藝，平行重復3次。

表1 L9(34)正交實驗因素水平表Table 1 Factors and their levels in L9(34)orthogonal array design

1.2.5 蛋白質含量測定 本實驗采用馬斯亮藍法測定蛋白質含量［16］。通過實驗數據繪制的蛋白質標準曲線線性回歸方程為:y=0.0049x－0.0069(R2=0.9989)。符合測定要求。

1.2.6 SOD酶活力測定 采用SOD活性測定試劑盒進行。根據蛋白質含量和酶活力測定值計算比活力。

2 結果與分析

2.1 單因素結果與分析

2.1.1 甲苯用量對SOD提取的影響 由圖1可知，甲苯用量不同時，所提取的SOD酶比活力不同。當甲苯用量為0.8mL/g時，SOD的比活力最高，提取效果最好，所以選擇0.8mL/g為SOD提取的較佳甲苯用量。這主要是由于當甲苯用量不足時，酵母細胞壁沒有得到充分破碎，導致SOD釋放不完全;過量的甲苯會影響SOD活性，導致酶比活力下降。

圖1 甲苯用量對SOD比活力的影響Fig.1 Effect of different amount of toluene on the activity of SOD

2.1.2 甲苯作用時間對SOD提取的影響 由圖2可知，甲苯作用時間不同，提取的SOD比活力不同。其中，甲苯作用時間為35min時所提取的SOD酶比活力最高，所以應選擇35min為較佳甲苯作用時間。當甲苯用量一定時，較短的作用時間，使酵母細胞壁破碎不充分，提取物中SOD含量較低，導致比活力較低;而較長的作用時間，雖然酵母細胞壁破碎較為充分，但也會導致酵母細胞中其他蛋白組分溶出，影響酶比活力。

圖2 甲苯作用時間對SOD比活力的影響Fig.2 Effect of different wall－broken time on the activity of SOD

2.1.3 甲苯作用溫度對SOD提取的影響 由圖3可知，當加入一定量的甲苯后，作用溫度不同時，所提取的SOD酶比活力存在差異。其中，當作用溫度為45℃時，所提取的 SOD酶比活力最高，所以選擇45℃為甲苯作用的最佳溫度。這是由于溫度過低時，不利于甲苯對酵母細胞壁的破碎，使SOD不能充分釋放;溫度過高，影響SOD穩定性，導致比活力下降。

圖3 甲苯作用溫度對SOD比活力的影響Fig.3 Effect of different temperature on the activity of SOD

2.1.4 磷酸緩沖液pH對SOD提取的影響 由圖4可知，當磷酸緩沖液pH為7.8時，SOD的比活力最高，提取效果最好，所以選擇pH7.8為SOD提取的較佳磷酸緩沖液pH。當磷酸緩沖液pH小于或大于7.8時，都會使所得到的SOD比活力下降，造成這一結果的原因可能是不同pH條件下SOD的活性存在差異，進而影響所得SOD酶比活力。

圖4 磷酸緩沖液pH對SOD比活力的影響Fig.4 Effect of different pH of phosphate buffer on the activity of SOD

2.2 正交實驗結果與分析

根據單因素實驗結果，以SOD比活力為考察指標，進行了L9(34)正交實驗，實驗結果見表2。通過直觀分析和方差分析得到最優組合，進行驗證實驗，確定甲苯法提取SOD的最優工藝。

由表2的數據結果可得出影響甲苯法提取葡萄酒酒泥酵母SOD因素的主次順序為:A＞C＞B＞D。甲苯法提取葡萄酒酒泥酵母SOD正交實驗的最優組合是 A2B1C3D3，即甲苯用量 0.8mL/g，作用時間25min，作用溫度50℃，磷酸緩沖液pH8.0。

表2 L9(34)正交實驗設計及結果表Table 2 L9(34)orthogonal array design arrangement and experimental results

用spss17.0統計軟件對實驗結果進行方差分析，其結果見表3。

表3 正交實驗方差分析結果Table 3 Analysis of variances for extraction yield of polysaccharides with various extraction conditions

由表3可知，甲苯用量、作用時間、作用溫度對SOD比活力影響顯著(p＜0.05)，對實驗結果影響較大。

2.3 驗證實驗結果

因正交實驗得到的最優組合在L9(34)中未出現，需對最優組合進行驗證實驗。在甲苯用量0.8mL/g，作用時間25min，作用溫度50℃，磷酸緩沖液pH8.0的條件下提取SOD。重復3次，SOD平均酶比活力為178.73U/mg，比正交實驗中最優組合得到的酶比活力高。

3 結論

本實驗以葡萄酒酒泥酵母為原料，通過L9(34)正交實驗確定的最優工藝參數為甲苯用量0.8mL/g，作用時間25min，作用溫度50℃，磷酸緩沖液pH8.0，在此條件下提取 SOD，所得 SOD平均比活力為178.73U/mg。

甲苯雖然具有一定毒性，但可通過后續的離子交換層析等工藝去除。因此，利用甲苯破壁法分離純化葡萄酒泥酵母SOD簡單易行，較為廉價，可為葡萄酒泥酵母開發生產SOD提供技術支持。

［1］林慶斌，廖升榮，熊亞紅，等.超氧化物歧化酶(SOD)的研究和應用進展［J］.化學世界，2006，4(6):378－379.

［2］李東旭，吳蕾.超氧化物歧化酶的提取和純化技術研究進展［J］.食品研究與開發，2008，29(3):183－184.

［3］李海，饒麗娟.超氧化歧化酶的研究現狀［J］.塔里木農墾大學學報，1998，2(6):10－11.

［4］FRIDOVICH.Superoxide radical and superoxide dismutases［J］.Annu Rev Biochem，1995，64(5):97－112.

［5］張彩瑩.不同來源的超氧化物歧化酶的部分理化性質比較研究［J］.安徽農業科學，2007，35(15):4426－4429.

［6］李宏，單振秀.利用幾種原料提取SOD的比較研究［J］.貴州農業科學，2009，37(3):93－94.

［7］SABARINATH SUNDARAM，SUNILKHANNA，RENU KHANNA－CHOPRA.Purification and characterization of thermostable monomeric chloroplastic Cu/Zn superoxide dismutase from Chenopodium murale［J］.Physiol.Mol.Biol.Plants，2009，15(3):199－203.

［8］ AMITRREDDI，LARANTJENSEN，AMORNRAT NARANUNTARAT，et al.The overlapping roles of manganese and Cu/Zn SOD in oxidative stress protection［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，2009，46(3):154－162.

［9］鄭鶴齡，張斌，潘潔，等.葡萄酒泥農業應用效果研究［J］.天津農業科學，2006，12(3):47－48.

［10］劉軍，李進，曲健，等.葡萄皮渣的綜合利用［J］.中外葡萄與葡萄酒，2012，18(3):51－53.

［11］ JAROMIRLACHMAN，MILOSLAVSULC，MAREK SCHILLA.Comparison of the total antioxidant status of Bohemian wines during the wine－making process［J］.Food Chemistry，2007，10(3):802－807.

［12］蘇昕，閻浩林，梁麗.酵母SOD分離純化及其酶學性質的研究［J］.沈陽藥科大學學報，2005，22(1):67－68.

［13］廖湘萍，徐功瑾，付三喬.利用啤酒酵母生產SOD的提取條件研究［J］.釀酒科技，2007，27(5):89－91.

［14］王歲樓，張平之，張鑫，等.從活性干酵母中直接提取SOD 的研究［J］.鄭州糧食學院學報，2000，21(2):66－68.

［15］劉曉艷，丘泰球，黃卓烈.不同方法對酵母細胞膜通透性的影響［J］.華南農業大學學報，2004，25(1):74－76.

［16］ TRAYANA NEDEVA，PAVLINA DOLASHKA －ANGELOVA，VESELA MOSHTANSKA，et al.Purification and partial characterization of Cu/Zn superoxide dismutase from Kluyveromyces marxianusyeast［J］.Journal of Chromatography B，2009，87(7):3529－3536.