皮蛋蛋白揮發性風味物質分析

趙 燕，涂勇剛，鄧文輝，李建科，王俊杰，羅序英

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047;2.南昌大學生物質轉化教育部工程研究中心，江西南昌330047;3.江西農業大學食品科學與工程學院，江西南昌330045)

皮蛋是我國特有的傳統蛋制品，具有悠久的加工歷史。除了和鮮蛋一樣含有豐富的蛋白質、氨基酸和脂肪酸以外，還有許多特有的品質，如風味獨特、色澤美觀、易被人體消化吸收等［1］。而且還有平肝、清涼、明目的功效，因此深受國內外消費者的喜愛。不同種類的禽蛋風味有所不同，各種蛋加工制品的風味也各具特色。目前，關于鮮雞蛋風味物質的鑒定［2］、不同飼料添加物對鮮雞蛋黃風味的影響［3］及蛋黃蛋白不同配比對炒雞蛋感官及風味造成極大的差異［4］等皆有報道，但是關于皮蛋中風味物質的研究卻不多。皮蛋是一種主要由堿腌制而成的蛋制品，風味獨特，蛋黃中的揮發性成分對皮蛋風味起著極其重要的作用［5］，蛋白中的揮發性成分對皮蛋風味的影響卻未探究。一般揮發性風味物質的含量甚微，所以較難富集。同時蒸餾萃取(simultaneous distillation extraction，SDE)是一種新的富集技術，其工作原理是經過加熱使萃取溶劑蒸氣和含有樣品組分的水蒸氣在裝置中充分混合，冷凝后兩相充分接觸實現組分的相轉移，在反復循環中實現高效的萃?。?］。與一些傳統的揮發性風味物質的濃縮富集方法如液－液萃取法、頂空法、吹掃捕集法等［7］相比，SDE具有設備簡單、操作方便、萃取效率高、成本較低［8］等優點，已被廣泛用于風味物質的提取富集［9－11］。本實驗采用同時蒸餾萃取與氣相色譜－質譜(gas chromatography－mass spectrometry，GC－MS)聯用技術，選取蒸餾萃取溫度、時間以及萃取溶劑用量三個對萃取結果影響較大的因素進行探討，優化蒸餾萃取條件，同時用GC－MS法對皮蛋蛋白以及新鮮鴨蛋蛋白中的揮發性風味物質進行定性分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皮蛋 自制;二氯甲烷(色譜純)、無水硫酸鈉(分析純，用前干燥處理) 天津市永大化學試劑有限公司;氮氣(純度99.999%) 華東特種氣體有限公司。

同時蒸餾萃取裝置;GC－2014C氣相色譜 日本島津公司;6980N－5973i氣－質聯用儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 稱取皮蛋蛋白10g，勻漿均勻后置于500mL燒瓶中，加入150mL蒸餾水，連接至蒸餾裝置的一端，用加熱套控制溫度100℃;另一端連接盛有二氯甲烷的燒瓶，水浴加熱，連續提取一段時間。提取結束后靜置5min，加入無水硫酸鈉除去水分，過濾。將濾液用 N2吹至0.2mL左右，GC－MS檢測。

鮮鴨蛋蛋白揮發性風味物質同上法制備。

1.2.2 SDE法提取揮發性風味物質的條件優化 取皮蛋蛋白10g，在水溶液100℃、二氯甲烷作為萃取溶劑的條件下對蒸餾萃取溫度、時間、萃取溶劑用量進行優化。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:HP－5毛細管柱(30m×0.25mm，0.25μm);升溫程序:起始溫度 50℃，保持1min，以 7℃ /min 升溫到 220℃，保持 10min，再以20℃/min升溫到 280℃，保持 10min;進樣口溫度250℃;載氣 He，流速 1.0mL/min;進樣量 1.0μL，不分流進樣。

質譜條件:離子源溫度 230℃，傳輸線溫度230℃，電離方式電子電離(electron ionization，EI)，電子能量 70eV，燈絲電流 150μA，掃描質量范圍30～450u。

2 結果與分析

2.1 SDE法提取條件優化

影響SDE萃取效率的主要因素有萃取溶劑的種類和用量、循環蒸餾－萃取的時間、溫度等［12］。二氯甲烷、三氯甲烷、正戊烷、異戊烷等［13－14］都可以作為SDE的萃取溶劑。因二氯甲烷沸點較低，密度較大，對半揮發性及揮發性組分都有較好的萃取效果，是一種較為常用的理想的萃取溶劑［10，15］，所以本實驗選擇二氯甲烷為萃取溶劑，并考察蒸餾萃取溫度、時間以及二氯甲烷的用量對皮蛋蛋白揮發性風味物質萃取效果的影響。

2.1.1 循環蒸餾萃取溫度的選擇 萃取溶劑和水溶液的溫度都會對蒸餾萃取結果產生很大的影響。雖然提高樣品與水的混合溶液的溫度有助于增強組分的蒸餾效率［16］，特別是對低揮發性組分的影響更為明顯。但是溫度越高，樣品發生如熱解、氧化及不穩定物質間相互反應等副反應的幾率也就越大，對樣品中不穩定組分的影響尤為明顯，對結果準確性的影響也就越大。所以實驗中選取混合溶液的溫度為水溶液的沸騰溫度 100℃。許多研究［10，17－18］中選用二氯甲烷作為萃取劑時一般將其蒸餾溫度控制在50～60℃，所以本實驗在水溶液溫度100℃、萃取時間1.5h、萃取溶劑60mL的條件下，考察了45、50、55、60、65℃的溶劑溫度對萃取效果的影響，結果見圖1。

圖1 蒸餾萃取溫度對萃取效果的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction efficiency of volatile flavor compounds

由圖1可知，溶劑溫度在45～55℃時，隨著溫度的升高，峰的個數隨之增多，當溶劑的溫度繼續升高時，峰數目開始減少，不過峰面積則一直呈增加趨勢。剛開始溫度升高，溶劑循環的速度隨之加快，與水蒸氣接觸的次數也就增多，萃取效果也就越來越好。但當蒸餾溫度繼續升高時，在萃取溶劑中的一些不穩定物質可能會發生反應，如酸和醇發生的酯化反應等，引起了峰數目的減少，由于實驗中峰面積不會對結果的定性分析產生較大的影響，所以實驗選取55℃為溶劑萃取溫度。

2.1.2 循環蒸餾萃取時間的選擇 循環萃取時間是影響萃取效率的又一重要因素［19］，許多實驗中選取1～4h作為蒸餾萃取時間［15，20－21］。本實驗在水溶液100℃、萃取溶劑55℃、萃取溶劑60mL的條件下，考察 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h 對萃取效果的影響，結果見圖2。

圖2 蒸餾萃取時間對萃取效果的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction efficiency of volatile flavor compounds

由圖2可以看出，萃取時間由1.0h增加至1.5h時，峰數目、峰面積都有所增加，但隨著時間的繼續延長，峰數目和峰面積都呈下降趨勢。這可能是由于不同物質與萃取溶劑之間存在平衡，而不同物質的揮發性不同。易揮發性組分極易被蒸餾、萃取，在1.5h內即可達到平衡，但隨著萃取時間的延長，它們會從萃取溶劑蒸氣中被再次蒸餾，有的甚至會完全消失［22］。同時，隨著循環萃取時間的延長，由于一些不穩定化合物之間發生副反應降低了其萃取效率。當萃取時間為1.5h時峰數目最多，所以實驗選取1.5h為蒸餾萃取時間。

2.1.3 溶劑用量的選擇 萃取溶劑的用量會影響待測組分在萃取液中的最后濃度，同時又決定了蒸餾速度［18］。增加萃取溶劑的用量可能有利于提高萃取效率。但是由于在后續的色譜分離測定時需要將SDE所得到的有機相收集液經濃縮至0.2mL左右，較大的溶劑用量會造成濃縮時間的延長，對易揮發化合物會有一定的損失，從而影響測定結果的準確性。實驗中在水溶液100℃、萃取溫度55℃、萃取時間1.5h 的條件下分別對 40、50、60、70、80mL 五個溶劑用量進行考察，結果見圖3。

圖3 萃取溶劑體積對萃取效果的影響Fig.3 Effect of solvent volume on extraction efficiency of volatile flavor compounds

文獻［12，19］報道，萃取溶劑的用量會對萃取率產生較大影響，但本實驗中卻并未觀察到明顯的現象。由圖3可知，隨著溶劑用量的增大，萃取率并沒有呈單一的升高或降低趨勢。但在后續溶劑濃縮過程中，很可能會造成易揮發化合物的較大損失，從而影響檢測結果。溶劑過少或過多都會增加檢測結果不準的幾率，實驗選取60mL為溶劑體積。

2.2 皮蛋蛋白中揮發性風味成分的分析

圖4為在最優提取條件下皮蛋蛋白中揮發性風味物質總離子流圖(并與鮮鴨蛋蛋白作對比)，用GC－MS對兩種蛋白的風味成分進行鑒定，結果見表1。由表1可知，皮蛋蛋白中共鑒定出26種風味物質:其中脂肪烴類8種(相對含量32.671%)，醇類1種(相對含量 0.694%)，醛類 3種(相對含量1.558%)，酮類2種(相對含量0.812%)，酯類5種(相對含量 44.818%)，芳香烴類 2種(相對含量14.94%)，酚類2種(相對含量1.061%)，含硫化合物類2種(相對含量1.809%)及胺類物質1種(相對含量1.638%);鮮鴨蛋蛋白中鑒定出27種物質，其中脂肪烴類9種(相對含量36.544%)，醇類1種(相對含量1.238%)，酮類1種(相對含量0.35%)，羧酸類2種(相對含量 1.549%)，酯類 4種(相對含量28.077%)，芳香烴類3種(相對含量20.9%)，酚類2種(相對含量2.67%)，含硫化合物類3種(相對含量4.028%)及胺類物質2種(相對含量4.641%)。

圖4 皮蛋蛋白和鮮鴨蛋蛋白中揮發性風味物質總離子流圖Fig.4 GC－MS total ion current chromatogram of volatile flavor constituents from preserved egg white and fresh duck egg white

表1 皮蛋蛋白和鴨蛋蛋白中揮發性風味物質的GC－MS分析結果Table 1 GC－MS analytical results of volatile flavor compounds of preserved egg white and fresh duck egg white

續表

兩種蛋白中共同含有的物質17種，其中脂肪烴類6種(苯乙烯、癸烷、十二烷、十四烷、二十烷、1，54－二溴－五十四烷)，酮類1種(7，9－二叔丁基－1－氧雜螺［4，5］－6，9－壬二烯－2，8－二酮)，酯類 3 種(鄰苯二甲酸二異丁酯、L－抗壞血酸－2，6－二棕櫚酸酯、鄰苯二甲酸二辛酯)，芳香烴類2種(間二甲苯、萘)，酚類2種(苯酚、2，6－二叔丁基對甲酚)，含硫化合物2種(環8原子硫、二－(1，1－二甲基癸基)二硫)，胺類1種(芥酰胺)。

在皮蛋蛋白中，酯類的含量最多(相對含量44.818%)，且大多是短鏈脂肪酸酯，它們都有其獨特的水果風味，因此它們對皮蛋蛋白風味的形成有重要的作用。如鄰苯二甲酸二辛酯可能有黃杏味［23］、L－抗壞血酸－2，6－二棕櫚酸酯可能具有芳香味等［24］。而鮮鴨蛋蛋白中含酯量則相對要少(相對含量28.077%)，同時在種類上也少于皮蛋蛋白中的，這可能是二者風味不同的重要因素之一。

在鮮鴨蛋蛋白中含有兩種羧酸類物質，不含醛類物質;相反的，在皮蛋蛋白中含有三種醛類物質，不含羧酸類物質。在揮發性物質中，羧酸主要來自于中性脂肪和磷脂的降解，它們對風味有著較大的影響，特別是一些短鏈脂肪酸，由于它們嗅覺閾較低，且本身具有特有風味，對整體風味影響更甚。如壬酸具有脂肪香味，十二酸可能具有蠟香等。一般在揮發性風味物質中，6個碳原子以上的飽和醛，閾值很低，會對風味產生很大的影響。短鏈醛可能具有清香、油香、脂香及強烈的刺激性氣味;分子量較高的醛可能具有橘子皮似的風味［25］。如壬醛有水果清香和脂香，癸醛具有刺激性氣味等。醛類物質可能是造成兩種蛋白風味不同的又一重要因素。

在兩種蛋白中都含有少量的酮類物質，雖然它們種類較少，閾值較高，對風味特征的貢獻不太大，但有些酮類對于雜環化合物的形成有重要的作用，是其重要的中間體，對香味的形成起著不可忽視的作用［26］。關于其來源，一方面可能來源于脂肪氧化，另一方面可能來源于脂肪熱降解，氨基酸的降解及美拉德反應［27］等。

在兩種蛋白中還含有少量的醇類物質，雖然它們含量也不高，但是由于其是長鏈或者不飽和醇類，自身具有特有風味，而且它們閾值較低，對風味形成的作用可能較大。2，2，4－三甲基－3－(3，8，12，16－四甲基－十七碳－3，7，11，15－四烯)－環己醇可能表現出清香、木香、脂肪香的特征［28］，2，6，10，15，19，23－六甲基－2，6，14，18，22－五烯基－二十四－10，11－二醇可能具有蘑菇香味［29］。

在兩種蛋白中都含有一些脂肪烴類。不過脂肪族烴類閾值較高，它們對風味貢獻應該較?。?0］。

在皮蛋蛋白中含有2種含硫化合物，1種胺類化合物;鮮鴨蛋蛋白中含有3種硫化物，2種胺類化合物。雖然它們種類和含量都不是很多，但是由于這些含硫化合物和胺類化合物的閾值很低，而且硫化物具有如硫樣香氣、洋蔥樣香氣以及辛辣等獨特的濃厚氣味［31］，噻唑類化合物具堅果香［32］，很大程度的影響著整個風味。鮮鴨蛋蛋白比皮蛋蛋白多1種硫化物和1種胺類化合物，而且鮮鴨蛋中這些胺類化合物的含量高于皮蛋中的含量，這就可能一定程度上決定了2種蛋白的特有風味。

3 結論

對同時蒸餾萃取條件進行優化，結果表明，在蒸餾萃取時間1.5h、水溶液溫度100℃、溶劑溫度55℃、萃取溶劑用量60mL的條件下，皮蛋蛋白中揮發性風味物質的提取富集效果最好。

采用氣相色譜－質譜聯用儀分析了皮蛋蛋白與新鮮鴨蛋蛋白經同時蒸餾萃取富集后的揮發性風味物質。皮蛋蛋白中測定出26種物質，其中脂肪烴類8種，醇類1種，醛類3種，酮類2種，酯類5種，芳香烴類2種，酚類2種，含硫化合物類2種及胺類物質1種;鮮鴨蛋蛋白中鑒定出27種物質，其中脂肪烴類9種，醇類1種，酮類1種，羧酸類2種，酯類4種，芳香烴類3種，酚類2種，含硫化合物類3種及胺類物質2種。

皮蛋蛋白和鮮鴨蛋蛋白中共有的揮發性風味物質有17種，其他部分不相同，說明腌制過程使鴨蛋蛋白中的揮發性風味物質發生了較大的變化。

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