高效液相色譜法測定葡萄酒中苯甲酸含量的不確定度評定

湯海青，顧曉俊，殷居易，歐昌榮

(1.寧波出入境檢驗檢疫局技術中心，浙江寧波315012;2.寧波大學海洋學院，浙江寧波315211)

苯甲酸及其鈉鹽作為酸性防腐劑，在食品行業中廣泛使用。根據我國相關食品安全國家標準，苯甲酸及其鈉鹽可被限量用于多類食品，包括蜜餞涼果、腌漬蔬菜、調味料、果蔬汁等，而葡萄酒等產品不在允許添加之列［1］。但由于葡萄酒在自然發酵生產過程中可能產生一定量的苯甲酸成分，所以GB 15037－2006《葡萄酒》中對苯甲酸或苯甲酸納(以苯甲酸計)并未規定不得檢出，而是給出了允許檢出的最高限量值［2］。在葡萄酒中人工添加苯甲酸及其鈉鹽，可抑制酵母和霉菌的生長，對細菌的生長也有一定作用。因此，苯甲酸及其鈉鹽可能被非法使用于葡萄酒的防腐和保藏，如總糖較高、酒精度較低的一類保質期相對較短的葡萄酒產品，特別應注意苯甲酸在假冒偽劣葡萄酒中的濫用。為了對檢測結果進行準確表達和有效評價，如實反映測量的置信度和準確度，本文采用GB/T 5009.29－2003《食品中山梨酸、苯甲酸的測定》中的第二法高效液相色譜法［3］，對一例苯甲酸含量在允許檢出的最高限量值50mg/L附近的樣品進行測定。并根據國家計量技術規范JJF 1059－1999《測量不確定度評定與表示》的要求［4－5］，使用實驗室內部確認的數據計算不確定度。對葡萄酒中苯甲酸測量結果的不確定度進行分析，為評定測量結果提供理論基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苯甲酸標準品(1.00mg/mL) 中國計量科學研究院;甲醇(色譜純) 美國天地公司;其余試劑 均為分析純。

LC－30A高效液相色譜儀 日本島津公司;梅特勒XS204電子天平、梅特勒T50M自動電位滴定儀 瑞士梅特勒公司;JULABO SW22恒溫水浴 德國JULABO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苯甲酸標準使用液的配制 將苯甲酸標準品于室溫(20±4)℃平衡10min，搖動均勻，用移液管移取10mL至100mL容量瓶，得到濃度為100μg/mL的標準中間液。用移液器分別準確吸取0.2、0.5、1.0、2.0mL至10mL容量瓶中定容，混勻后為2、5、10、20μg/mL標準使用液。

1.2.2 樣品前處理 準確移取10.0mL葡萄酒樣品，放入燒杯中，水浴加熱除去乙醇，氨水(濃氨水∶水=1∶1)調pH約7.0，用超純水定容至25.0mL，經0.45μm濾膜過濾。作為待檢測樣品，同時做空白對照。

1.2.3 試樣測定 按島津高效液相色譜操作規程規定的程序開機平衡系統，待基線穩定后，取制備好的待測樣品液進樣分析，記錄色譜圖，用多點法峰面積校準定量。色譜條件:色譜柱為Hyersil BDS C18柱，流動相為 0.02mol/L乙酸銨溶液/甲醇(85/15，V/V)，柱流速 1mL/min，進樣量10μL。

1.3 數學模型的建立

樣品中苯甲酸含量計算公式如下:

式中，X為樣品中苯甲酸含量(mg/L);C為樣品苯甲酸濃度(μg/mL);V為樣品最終定容體積(mL);Vm為樣品體積(mL);F為稀釋因子。

上述計算公式是由測量原理得出的，沒有考慮各種隨機因素對不確定度的影響，在此應引入反映隨機影響的重復性系數frep，其數值等于1。評定不確定度的數學模型應寫成如下形式:

1.4 測量不定度來源

根據檢測過程和數學模型，不確定度的主要來源有:平行實驗重復性產生的相對標準不確定度u(frep);移取樣品體積產生的相對不確定度u(Vm);試樣前處理定容體積引起的相對不確定度u(V);標準溶液濃度引起的相對不確定度u(C);液相色譜儀定量重復性產生的相對不確定度u(LC)。相對標準不確定度計算公式見式(3):

u(X)=［u(frep)2+u(Vm)2+u(V)2+u(C)2+u(LC)2］－1式(3)

2 結果與分析

2.1 測量重復性產生的標準不確定度

在重復條件下，對葡萄酒樣品進行7次測量，測量數據見表1。

表1 平行測量結果Table 1 Results of parallel determination

單次測量的實驗標準偏差為:

在日常分析中，測定兩份樣品報告平均值，故平均值的相對標準不確定度為:

該測量重復性標準偏差是本測量所有隨機影響的合成，因此在隨后各分量的評定中無需再考慮隨機影響。

2.2 樣品移取體積的相對標準不確定度u(Vm)

用10mL A級單標線移液管移取樣品，按照計量檢定規程JJG 196－2006［6］，最大容量允差為0.020mL。按均勻分布(矩形分布)考慮，由此引入的相對標準不確定度為實驗室的溫度在±4℃之間變動，考慮溶液溫度與校正時溫度差引起的體積不確定度。假設溫度變化時矩形分布，用水的膨脹系數(2.1×10－4/℃)計算，產生的體積變化引起的相對不確定度為合成得到樣品移取體積的相對標準不確定度:

2.3 定容體積的標準不確定度

本次實驗樣品定量總體積為25mL，采用25mL A級容量瓶定容，按照JJG 196－2006，最大容量允差為±0.03mL。按三角形分布考慮，由此引入的相對標準不確定度為實驗室的溫度在±4℃之間變動，考慮溶液溫度與校正時溫度差引起的體積不確定度。假設溫度變化時矩形分布，產生的體積變化引起的相對不確定度為合成得到樣品移取體積的相對標準不確定度:

2.4 苯甲酸標準溶液的相對標準不確定度

2.4.1 液體標準品引入的不確定度 根據苯甲酸標準物質證書，苯甲酸溶液標準物質的標準值為1.00mg/mL，相對擴展不確定度為1%，包含因子k=2，因此其相對標準不確定度u(C1)=0.005。

2.4.2 由苯甲酸標準儲備液稀釋配制標準工作液產生的標準不確定度u(C2) 將10mL標準品溶液一次性全部轉移至100mL A級容量瓶，稀釋至濃度100μg/mL。再用微量可調移液器移取標準稀釋液 200、500μL、1.0、2.0mL 至 10mL A 級容量瓶中并定容，配制成 2、5、10、20μg/mL 的苯甲酸標準系列工作液。產生的不確定度

按照JJG 196－2006，100mL A級容量瓶的最大容量允差為±0.10mL。按三角形分布考慮，由此引入的相對標準不確定度為;考慮溶液溫度與校正時溫度差引起的體積不確定度0.00048。合成得到樣品移取體積的相對標準不確定度:

微量可調移液器允差±0.6%，按矩形分布，由此引入的相對標準不確定度為:

10mL A級容量瓶的最大容量允差為±0.02mL。按三角形分布考慮，由此引入的相對標準不確定度為?？紤]溶液溫度與校正時溫度差引起的體積不確定度0.00048。合成得到樣品移取體積的相對標準不確定度:

上述不確定度互不相關，合成得:

2.4.3 校準曲線擬合引入的標準不確定度u(C3)制備4個苯甲酸標準溶液ci，每個濃度測定3次，得到4×3共12個峰面積—濃度值(cij，Aij)，測定結果見表2。

表2 標準溶液校準曲線Table 2 Calibration curve of standard solution

用最小二乘法擬合，截距a=3.0294×10－5，斜率b=0.02893，得標準曲線 Aij=3.3 ×104cij－954.78。

實際測定中，對待測樣液測定2次(p=2)，響應值分別為133792和134843，代入公式，求得預估濃度值 c=4.04μg/mL。

由標準工作曲線求c時產生的s(y)標準不確定度為0.013。則標準曲線引入的相對不確定度 s(Cp)為:

2.4.4 苯甲酸標準溶液的相對標準不確定度 將上述各不確定度分量合成得到苯甲酸標準溶液的相對標準不確定度為:

2.5 由高效液相色譜儀產生的相對標準不確定度

由校準證書上可知，島津高效液相色譜儀的定量重復性誤差為1.0%，按均勻分布計算，則液相色譜儀的相對標準不確定度為

2.6 不確定度的合成

上述各項不確定度分量(見表3)互相獨立，葡萄酒樣品中苯甲酸的相對合成標準不確定度為:

u(X)=X［u(frep)2+u(Vm)2+u(V)2+u(C)2+u(LC)2］－1=0.49μg/mL

表3 不確定度分量Table 3 List of uncertainty components

2.7 擴展不確定度及結果

取包含因子k=2，置信水平約為95%，以全進法修約，計算擴展不確定度U(X)=0.49×2=0.98≈1mg/L。按 GB/T 5009.29－2003《食品中苯甲酸、山梨酸的測定》中的第二法規定的條件測定葡萄酒樣品中的苯甲酸(計算結果保留兩位有效數字)，測得平均值及其不確定度為(51±1)mg/L，包含因子k=2，置信水平約為95%。

3 結論

通過對測定苯甲酸過程中產生的不確定度進行量化，說明本實驗中高效液相色譜法測定葡萄酒樣品的苯甲酸含量過程中，由標準溶液和液相色譜儀引入的不確定度為主要來源，其次為測量重復性和移取樣品體積引入的不確定度。根據CNAS－GL27聲明檢測和校準結果及與規范符合性指南［7］，當測試結果高于上限或低于下限，而延伸擴展不確定度與上限或下限迭交時，則在95%的置信水平上不能聲明符合或是不符合標準。在置信水平低于95%的情況下，可能做出不符合規范的聲明。本實驗中結果值51mg/L高于規定上限值50mg/L，向下延伸不確定度后的結果值與上限值迭交，因此在95%的置信水平上不能聲明符合或是不符合標準。

［1］中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB 2760－2011，食品安全國家標準 食品添加劑使用標準［S］.北京:中國標準出版社，2011.

［2］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB 15037－2006葡萄酒［S］.北京:中國標準出版社，2007.

［3］中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.29－2003，食品中山梨酸、苯甲酸的測定［S］.北京:中國標準出版社，2004.

［4］國家質量技術監督局，JJF 1059－1999測量不確定度評定與表示［S］.北京:中國計量出版社，1999.

［5］中國合格評定國家認可委員會，CNAS－GL 06化學分析中不確定度的評估指南［S］.北京:中國計量出版社，2006.

［6］國家質量監督檢驗檢疫總局，JJG 196－2006常用玻璃量器檢定規程［S］.北京:中國計量出版社，2006.

［7］中國合格評定國家認可委員會，CNAS－GL27聲明檢測和 校準結果及與規范符合性指南［S］.北京:中國計量出版 社，2009.