水相組分差異對大豆蛋白-磷脂復合乳化體系的影響

王 妍，李 楊，江連洲，張雅娜

（東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

傳統豆制品在加工中易形成乳化體系，其中存在的大豆蛋白與磷脂的交聯作用對乳化體系有一定影響。大豆貯藏蛋白主要成分為7S和11S。它們占貯藏蛋白70%左右。7S疏水性氨基酸含量高，11S含硫氨基酸含量高[1]。由于7S球蛋白和11S球蛋白在亞基組成、氨基酸組成等方面均有較大差異，使它們對大豆蛋白的功能特性產生不同的貢獻[2]。大豆蛋白作為食品工業中不可或缺的原配料，所具有的各種功能特性不斷被發現，其中乳化性是較為重要的一種性質，其原理是利用蛋白質分子結構中的親水、親油基，吸附在油-水界面上，形成一層膜，從而阻止油滴的聚集，達到穩定乳化的作用[3]。乳狀液的制備需要乳化劑，近年來，人們對乳狀液的使用和形成產生很大興趣。大多數文獻研究了乳狀液的形成，穩定及其他性質。眾所周知，磷脂可以充當乳化劑制備乳狀液，Akhtar和Dickinson用卵磷脂充當乳化劑制備復合乳狀液[4]。Fang和Dalgleish發現低濃度磷脂可以提高O/W乳狀液穩定性[5]，近年發現溶液中表面窗體頂端活性劑和不同蛋白質可以相互作用，形成具有不同特性的蛋白質-表面活性劑復合物[6]。Catharina研究發現蛋白質-磷脂交互作用有利于提高牛乳的熱穩定性[7]。Annett Knoth研究發現當問含有磷脂的乳狀液中加入乳清蛋白時，乳狀液的粒徑大小和穩定性均有變化[8]?；诖蠖沟鞍椎慕M成和結構是影響乳化性的一個重要因素，該研究通過分離純化出大豆分離蛋白及其主要組分7S及11S球蛋白，對不同蛋白與磷脂混合形成復合乳化體系的乳化性及流變性進行測定，從而找出7S、11S對大豆蛋白-磷脂復合乳化體系乳化性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂豆粕 哈高科提供；大豆磷脂 深圳康之源生物有限公司；金龍魚大豆調和油 超市購買；SDS、磷酸鹽 均為分析純。

pH S-25酸度計 上海偉業儀器廠；電子分析天平 梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司；T18 basic高速乳化均質機 英國IKA公司；722S分光光度計上海精密科學儀器有限公司；微量取樣器 上海榮泰生化工程有限公司；磁力攪拌器、機械攪拌器 廣州儀科實驗儀器有限公司；流變儀 英國馬爾文儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白SPI的提取 采用Molina Ortiz等的方法[9]。脫脂大豆粉→攪拌（料液比1∶20，提取時間2h，25℃）→離心→上清液（2mol/L HCl調至pH4.5在4℃靜置2h）→離心20min（2000r/min）→沉淀（復溶于5倍蒸餾水）→冷凍干燥→SPI

1.2.2 7S和11S的提取 7S和11S的提取參考Nagano的實驗方法[10]。脫脂豆粉→提?。?5倍水，2mol/L NaoH調pH7.5，室溫提取1h）→離心（9000×g 20min）→上清液→加NaHSO3，2mol/L HCl調至pH6.4，4℃過夜→離心（6500×g，20min，4℃）→沉淀（11S）

↓

上清液→用NaCl調離子濃度0.25mol/L，2mol/L HCl調至pH5.0，靜置1h→離心（9000×g，30min，4℃）→上清液→用水稀釋兩倍，2mol/L HCl調至pH4.8→離心（6500×g，20min，4℃）→7S

1.2.3 7S/11S的確定 采用不連續十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）方法[11]，濃縮膠和分離膠中SDS濃度為0.1%、過硫酸銨濃度為0.075%、四甲基乙二胺（TEMED）濃度為0.075%，聚丙烯酰胺濃度分別為2.5%和10%，濃縮膠中緩沖液濃度為0.125mol/L Tris-HCl（pH6.8），分離膠中緩沖液濃度為0.375mol/L Tris-HCl（pH8.8），貯液槽中緩沖液濃度為0.025mol/L Tris-HCl/0.192mol/L甘氨酸（pH8.3）。用0.0625mol/L Tris-HCl（pH6.8）樣品緩沖液（該緩沖液同時含有2%SDS、5%2-巰基乙醇、10%甘油、0.002%溴酚藍）溶解一定量分離蛋白粉，配成濃度為1mg/mL的溶液。超聲波水浴處理45min，在沸水中加熱3min。點樣量為15μL，穩壓電壓50V進行電泳。電泳結束后，進行固定、染色、脫色。電泳譜圖采用CS910型薄層掃描儀進行掃描后，用ScionImage軟件進行處理分析。

1.2.4 大豆基本指標測定 水分及揮發物含量測定[12]：GB/T 5009.3-2003，直接干燥法；灰分含量測定[13]：GB/T 5009.4-2003，灼燒稱量法；粗蛋白含量測定[14]：GB/T 5009.5-2003，半微量凱氏定氮法。

1.2.5 乳狀液的制備 精確稱取1g樣品，溶解于100mL 0.1mol/L磷酸鈉緩沖溶液中，室溫下1000r/min攪拌1h制備蛋白溶液，取0.1g磷脂溶解于大豆油中，室溫下1000r/min攪拌1h。取15mL攪拌均勻的蛋白溶液與5mL溶有磷脂的大豆油混合，在高速乳化均質機下13500r/min乳化2min后倒入25mL燒杯中。

1.2.6 乳化性及乳化穩定性的測定 乳化性的測定參考Molina等[15]的實驗方法，分別于0、30min時，在燒杯底部取樣20μL乳狀液與5mL 0.1%的SDS溶液均勻混合，在500nm處測定其吸光值。

式中：T=2.303；N：稀釋倍數（250）；C：乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質濃度（g/mL）；φ：乳化液中油相體積分數（0.25）；A0：0min時吸光值；A30：30min時吸光值。

1.2.7 乳狀液黏度的測定 采用Bohlin-CVO流變儀，4/40椎板，測定溫度25℃，剪切速率從0.01s-1到100s-1測定表觀粘度。

1.2.8 粒徑的測定 采用Malvern激光粒度分析儀測定粒度分布，測定溫度25℃。

2 結果與討論

2.1 大豆基本指標測定

按照1.2.4方法測得的大豆基本指標，如表1所示。

表1大豆基本指標Table 1 Basic index of soybean

2.2 凝膠電泳圖譜分析

大豆7S、11S球蛋白及SPI凝膠電泳圖譜見圖1。通過對SDS－PAGE譜圖中的譜帶進行Scion Image掃描分析，7S的純度達到78.2%，11S的純度達到88.7%，SPI中7S和11S比例約為4∶6。

圖1 7S、11S球蛋白及SPI電泳圖譜Fig.1 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of 7S、11S globulin and SPI fractions

2.3 乳化性及乳化穩定性分析

圖2 蛋白-磷脂復合體系的乳化性Fig.2 The EAI of soybean protein-lec complex emulsions

不同蛋白與磷脂交互形成的復合乳化體系乳化性及乳化穩定性見圖2和圖3。從圖中可看出乳化能力：7S＞SPI＞11S，穩定性：7S＞SPI＞11S。蛋白與磷脂相互作用形成一種蛋白質-卵磷脂復合物，7S的疏水氨基酸含量高，在它的表面存在大量的疏水區，所以它能較快的吸附在油滴的表面，并且在油滴的表面與磷脂形成一種更穩定的復雜結構。而11S因其內部含有亞基間和亞基內的二硫健，使氨基酸殘基重排從而降低了吸附在油滴表面的速度。另外11S帶高電荷也是造成吸附延誤的原因。因此7S更易與磷脂形成7S-磷脂復合物，導致7S-磷脂復合乳化體系乳化性比11S-磷脂高。有研究證明，7S在任何pH下都比11S有更好的降低表面張力的能力[16]，所以復合乳化體系的水相添加7S比11S穩定性也更好。而SPI-磷脂復合乳化體系的乳化性和乳化穩定性是7S和11S共同作用的結果。

圖3 蛋白-磷脂復合乳化體系的乳化穩定性Fig.3 The ESI of soybean protein-lec complex emulsions

2.4 黏度分析

通過流變儀測得不同蛋白與磷脂交互形成的復合乳化體系的黏度，見圖4。從圖4中可看出，7S-磷脂復合乳化體系黏度低于11S-磷脂復合乳化體系。復合體系的粘度有兩個主要影響因素，一是連續相的濃度，二是連續相的連續性。通過乳狀活性的測定，證實7S更易與磷脂形成一種蛋白質-卵磷脂復雜物，形成的這種結構破壞了連續相的連續性，因此7S與磷脂交互形成的乳狀液體系的黏度最低，11S最高，SPI是7S和11S共同作用的結果。另一方面，蛋白質是高分子體系，溶解后具有一定的凝膠性，使得溶液黏度增加。在中性范圍內，大豆蛋白11S蛋白含有18～20個雙硫鍵，疏水性基團也多于7S蛋白，酸性亞基和堿性亞基通過雙硫橋鍵連接，分子所形成的空間網狀結構比較復雜，也比較牢固，有利于蛋白質的膨脹，使得溶液的黏度也隨之增加。

圖4 蛋白-磷脂復合乳化體系的流變曲線Fig.4 The flow curves of soybean protein-lec complex emulsions

2.5 粒徑分析

由圖5可看出，粒徑分布曲線都出現雙峰現象，雙峰的出現表明乳狀液的分布不均勻，分散性不是很好，這可能是由于均質不均勻造成的。

水相添加7S形成的乳狀液不存在過大的凝聚顆粒，小顆粒液滴的數量較多，乳狀液的平均粒徑小于11S，可能是磷脂與7S作用后形成的7S-磷脂復合物比與11S作用后形成的11S-磷脂復合物能更好的降低界面張力，而且7S比11S有更好的乳化活性，因此促進小尺寸的液滴形成。而SPI的粒徑大小由7S和11S共同決定，從粒徑分布曲線可看出其粒徑大小處于7S和11S之間。

圖5 蛋白-磷脂復合乳化體系的粒徑分布曲線Fig.5 The particle size distribution of soybean protein-lec complex emulsions

3 結論

用含有磷脂的大豆油當油相，制備乳狀液時，水相添加物不同蛋白分子對復合乳化體系的性質影響顯著，當水相添加7S時有助于復合乳化體系的形成，形成的液滴粒徑較小，黏度較低，形成的復合乳化體系穩定性也比添加11S更好。

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