成年雄性斑胸草雀前腦與中腦對習得性發聲控制的側別差異

曾賢燕, 李東風

華南師范大學 生命科學學院, 廣東省高等學校生態與環境科學重點實驗室, 廣州 510631

成年雄性斑胸草雀的習得性發聲包括長鳴和鳴唱, 長鳴具有性別二態性, 鳴唱則為雄性特有(Simpson & Vicario, 1990), 兩者都是由前腦高級發聲中樞控制產生。

雄鳥在幼齡期通過模仿和聽覺反饋獲得習得性發聲(Brainard & Doupe, 2002; Funabiki &Funabiki, 2009)。鳴禽腦內離散核團和它們之間的連接形成了發聲神經控制系統, 與非鳴禽不同的是，其前腦內有較多且功能復雜的發聲核團。習得性發聲信號由前腦高級發聲中樞 (high vocal center,HVC)啟動, 隨后或直接下行至前腦的弓狀皮質櫟核(robust nucleus of the arcopallium, RA), 此通路稱發聲運動通路(vocal motor pathway, VMP); 或途經前端腦環路(其中包括基底神經節的X區“X area”、丘腦背外側核“medial portion of the dorsolateral nucleus, DLM”和新紋狀體前部巨細胞核外側部“lateral magnocellular nucleus of the anterior neostriatum, LMAN”, 后再行至RA, 此通路稱前端腦通路(anterior forebrain pathway, AFP)(Doupe et al,2005; Nottebohm, 2005; Doupe et al, 2004; Troyer &Bottjer, 2001)。RA作為發聲控制通路中前腦的最后一級輸出核團, 其整合了來自 HVC和前端腦環路的控制信號, 繼續發出指令引導下游核團完成發聲控制, 是發聲控制系統中高級中樞與低級中樞的分界點。研究發現, 雌性鳴禽的 RA核團極度萎縮(Nottebohm & Arnold, 1976; Li et al, 1992)且不與中腦基本發聲中樞形成突觸連接(Fukushima & Aoki,2002), 以致雌性鳴禽不善唱; 雄性鳴禽的RA核團的體積為雌性的數倍, 若損毀兩側RA則令雄性長鳴喪失習得性成分, 與雌鳥的長鳴相似, 這足以說明 RA在雄性鳴禽習得性發聲中的重要作用。Vicario et al (2001)報道, 雄性特異性的長鳴需要有完整的RA結構, 當兩側RA被損后, 雄鳥的長鳴不僅失去原來的特征, 其對聲音刺激的反應也與正常雄鳥不同, 而與雌鳥的類似, 所以 Vicario et al(2001)認為雄鳥的 RA核團是控制發聲行為的性別差異性的關鍵核團。丘間復合體背內側核(dorsomedial nucleus of the intercollicular complex,DM)位于中腦丘間核(nucleus intercollicularis, Ico)內, 是鳥類最基本的發聲中樞(Gurney, 1980;Kojima & Aoki, 2003), 可以不依賴于前腦直接控制簡單發聲, 在雄性鳴禽中, DM核團接受RA投射神經元的信息輸入, 是習得性發聲信號位于中腦的重要中間站, 其發出神經投射至位于延髓的舌下神經氣管鳴管亞核(nⅫts), 完成發聲控制。Fukushima &Aoki (2002)報道, 刺激兩性鳴禽DM核團能誘發出類似長鳴的鳴叫, 鳴叫的時程變化與刺激的脈沖數相關, 鳴叫的頻率變化(只有雄鳥才有)與刺激的脈沖頻率有關, 因此, 雄鳥 DM 由于接受了來自 RA的突觸輸入也是個具有性別差異的發聲核團。

本研究為探討成年雄性鳴禽前腦與中腦對習得性發聲的影響, 采用電損毀與聲譜分析相結合的方法, 依次電損毀成年雄性斑胸草雀單側 RA與DM核團并采集兩次手術前后的長鳴和鳴唱。使用聲音分析軟件對收集到的長鳴和鳴曲進行處理和分析, 通過分析習得性發聲的變異情況來推測核團的控聲機理。單側損毀控聲核團的方法既能分析腦內發聲信號控制模式又避免了動物失音。

1 材料方法

選用健康成年雄性斑胸草雀(Taeniopygia guttata)25只，年齡＞90 d，體重12～15 g。購于廣州花地灣花鳥蟲魚市場，并在華南師范大學生命科學學院動物房飼養。實驗動物使用符合國家和學校動物倫理委員會規定并遵守國際慣例。

1.1 實驗流程

(1) 采集正常狀態下的成年雄性習得性聲音(pre-operation, Pre); (2) 第一次損毀手術，電損毀單側 RA核團; (3) 1—2天后采集第一次術后聲音(post- operation 1, Post 1; (4) 間隔5—7天，第二次損毀手術電損毀同側DM核團; (5) 1—2天后采集第二次術后聲音(post-operation 2, Post2); (6) 組織學檢驗。

1.2 聲音采集及分析

將單只雄鳥置于測聽室內, 定向話筒靠近籠壁,距離鳥～25 cm, 每天錄音1.5 h, 連續錄音3 d, 采樣頻率為44 100 Hz, 單聲道, 16位分辨率, 取得正常狀態下、手術后的聲音樣本, 數字化信息保存為*.wav文件。使用Cool Edit 2000軟件對鳥鳴進行錄制和篩選, 讀取高端頻率(high frequency, HF);Wavesurfer聲音分析軟件繪制語圖、波形圖, 讀出基頻(fundamental frequency, FF)(Li & Geng, 2005);SAP聲音分析軟件(Version1.02)Explore & Score界面下進行語圖分析, 讀出時程(duration)、音高(pitch)、調頻(frequency modulation, FM)及振幅(amplitude)等值。此外, SAP軟件支持聲音比對分析,即將兩組聲音輸入該軟件能得出這兩組聲音在形態結構等綜合因素上的相似值(Tchernichovski et al,2000)。采集的聲譜圖、時間波形圖等用 Photoshop軟件(Version7.0.1)排版作圖。利用 SPSS軟件(Version 11.5)進行組內單因素方差分析(ANOVA)。數據用均值±標準差(mean±SD)表示。t-test計算差異顯著性, P＜0.05顯著性差異, P＜0.01差異極顯著。利用Origin軟件(Version 8.0)繪制統計圖。

1.3 腦內核團電損毀

動物麻醉, 胸大肌注射～0.03 mL10%水合氯醛, 數分鐘后動物進入麻醉狀態, 剪去頭頂及耳孔處毛。在立體定位儀上固定頭部, 兩耳桿伸入耳孔抵著耳前骨, 喙桿上固定喙, 使頭部向下傾斜 45°,頭部固定完畢。剪開頭皮暴露顱骨, 可見人字縫,將人字縫交點處作為零點, 依據斑胸草雀腦圖譜(Nixdorf-Bergweiler & Bischof, 2007)定位核團, 用尖頭鑷子在顱骨上開直徑～1 mm 小孔, 揭開腦膜后, 自電極尖端接觸腦表面算起, 下電極至坐標深度, 打開刺激器開關, 先調至脈沖輸出模式, 后調至恒流電模式1 mA, 10 s, 完成損毀, 抽離電極, 止血封閉傷口。

1.4 灌流取腦制片

動物麻醉, 胸大肌注射～0.05 mL 10%水合氯醛; 仰臥固定于手術板, 剪去頸部毛, 剪開頸部皮膚, 暴露頸總動脈, 分離頸部兩側大靜脈。先用0.75%生理鹽水頸動脈灌注5 min, 再換4%多聚甲醛固定液灌注約30 min, 剝去顱骨取全腦浸泡在多聚甲醛固定液中固定24 h, 換30%蔗糖溶液浸泡至標本沉底。使用冰凍切片機將鳥腦冠狀切片, 片厚40 μm, Nissl染色后中性樹脂封片, 鏡檢。

2 結 果

2.1 損毀右側核團對雄性長鳴造成顯著影響

正常狀態下雄性斑胸草雀長鳴頻率范圍500～20 000 Hz, 基頻穩定, 諧波清晰, 最強能量帶在3 000～6 000 Hz之間; 富含快速調頻特性, 即聲音頻率在極短時間內(15～50 ms)快速上升, 后緩慢下降, 聲音婉轉動聽(圖1左)。該聲音在地面可傳播100 m, 故亦稱長距離鳴叫(distance call)。

圖1 右側實驗組3個階段長鳴語圖Figure 1 Sonogram of male’s long call of right sideexperimental group at three stages左圖：對照; 中圖：損毀右側RA后的長鳴; 右圖：再損毀右側DM后的長鳴。Left: control; Middle: right side RA lesion; Right: right side DM lesion following RA lesion.

圖2 右側損毀組3個階段長鳴的量化分析 (n=5例)Figure 2 Quantification of long call in adult male zebra finches (n=5) at three stages with lesions on right sidePre(白)：手術前; Post1(淺灰)：第一次手術后; Post2(深灰)：第二次手術后。圖A：手術前后鳴叫時程的差異, 右側RA損毀后鳴叫時程延長了1.1倍, 而接著右側DM損毀后鳴叫時程又延長了0.9倍, 兩次手術共使長鳴時程延長了1.2倍。圖B：手術前后鳴叫音高的差異, 右側RA損毀后, 長鳴音高下降了37%, 但DM損毀后音高沒有再出現明顯變化。圖C：手術前后調頻的差異, RA損毀后調頻值下降了40%, 接著DM損毀后該值再次下降了31.9%。圖D：手術前后振幅的變化存在個體差異性。Pre: preoperation (white), Post1: postoperation1(light gray), Post2: postoperation2 (dark gray). A: Differences in call duration before and after operations. 1.1 times elongation after RA was destroyed and 0.9 times elongation after DM was destroyed, the total elongation of both operations was 1.2 times compared with the control. B: Differences in pitch before and after operations. After RA was destroyed, long call pitch decreased 37%, but no more changes were observed after DM was destroyed. C: Differences in frequency modulation before and after operations. After RA was destroyed, the FM value decreased by 40%, with a further 31.9% decrease after DM was destroyed. D: Changes in amplitude before and after operation showed individual differences.

損毀右側RA核團后, 長鳴失去快速調頻特性,諧波變得平緩, 諧波條紋模糊; 主能量帶寬擴大,界線不清; 時程出現顯著延長(圖 1中)。將音頻數字化后分析, 發現各聲學參數與損毀前相對比均出現了顯著差異：鳴叫時程由165.39 ms (x)延長至184.1927 ms (), 鳴叫時程延長約1.1倍; 音高(音調) 由1 151.19 Hz (x) 降至728.5138 Hz (), 降幅為 37%, 聲色由高亢變低平; FM 值 (調頻指數)由34.93(x)變至 20.9174(), 降幅為40%, 叫聲不再婉轉; 振幅無明顯變化, 有個體差異性(圖2)。此時的長鳴已不具有雄性長鳴的特征, 與雌性非習得性長鳴在時域和頻域上都十分相似。

RA損毀后1～2 d動物已恢復常態, 采集足夠聲音信號, 5～7 d后進行同側DM核團的損毀。兩次術后, 從語圖上觀長鳴的結構與第一次術后的相比無明顯差異(圖 1右)。繼續發生變化的聲學參數有：長鳴時程, 此時長達 201.44 ms(), 長鳴時程再次顯著延長 9%, 兩次手術共使雄鳥的長鳴延長了1.2倍; 音高降為653 Hz (x), 與第一次術手相比下降 10%, 諧波模糊, 音色暗啞; FM 值降為14.2472(x), 第二次術后再次下降 31.9%, 聲音趨于恒頻(圖2)。

損毀右側RA核團后長鳴的聲學結構與正常時的相比相似度僅為67%, 進而右側DM核團缺失后相似度與正常相比不到60%, 但與第一術后相比沒有明顯差異, 即第二術后叫聲結構沒有再發生顯著變化(圖 3)。

2.2 損毀左側核團未對雄性長鳴造成影響

圖4為左側損毀組語圖。圖中由左到右分別是術前正常狀態下的雄性長鳴、左側RA核團電損毀后的長鳴、左側DM核團電損毀后的長鳴。手術前后的聲音均未呈現明顯的變化, 無論是從諧波的走向、能量帶的分布還是時程上的特征。將各聲學參數提取出來進行組內單因素方差分析, 如表1所示,長鳴的時程、音高(音調)、FM、振幅 (響度) 在術前術后3個階段均未出現顯著性差異(P＞0.05)。

圖3 右側損毀組手術前后長鳴結構的相似度比較Figure 3 Similarity score of long call construction before andafter operations with lesions on right sidePre/Post1(白)：右側RA損毀后長鳴的結構與正常相比僅有67%的相似度；Pre/Post2(淺灰)：右側DM損毀后長鳴的結構與正常相比亦只有較低的相似性；Post1/Post2(深灰)：第一次術后與第二次術后長鳴結構相似度較高說明第二次損毀并未影響聲學結構。Pre/Post1 (white): call construction after right side RA was destroyed had only 67% similarity compared with control. Pre/Post2 (light gray): low similarity compared with control after right side DM was destroyed.Post1/Post2 (dark gray): similarity of Post1 and Post2 was high, indicating that the second lesion operation did not affect the acoustic construction.

圖4 左側實驗組長鳴語圖Figure 4 Sonogram of male’s long call of left sideexperimental group at three stages左圖：對照; 中圖：損毀左側RA后的長鳴; 右圖：再損毀左側DM的長鳴。Left: control; Middle: left side RA lesion; Right: left side DM lesion following RA lesion.

表1 左側實驗組3個階段長鳴的聲學參數Table 1 Acoustic parameters of left side experimentalgroup’s long calls in three stages

2.3 右側核團損毀造成鳴曲音節改變

鳴唱是雄性鳴禽特有的習得性發聲, 鳴曲中富含著習得性的社交意義。鳴曲是成串的聲音信號,它由一至多個序幕音(i)引出的若干串由相同或不同音節(s)組成的短句構成。

圖5 右側實驗組鳴曲語圖Figure 5 Sonogram of lesioned right side experimental group in three stages上圖：對照; 中圖：右側RA損毀后鳴曲; 下圖：右側DM損毀后鳴曲(黑色箭頭指示快速調頻特性, 空心箭頭指向基頻)?！癷” 表示序幕音; “s” 表示音節。Top: Control song; Middle: Song with right side RA lesion; Bottom: Songwith right side DM lesion with prior ablation of ipsilateral RA (black arrow indicates fast frequency modulation, hollow arrows direct to the fundamental frequency.). i: introductory note; s: syllable.

分側損毀結果發現右側手術組的鳴曲出現顯著變化, 而左側則不明顯。圖5所顯示的是同一只進行右側損毀的成年雄性斑胸草雀術前術后3個階段的曲鳴差異。圖 5的上圖為對照鳴曲; 中圖為右側RA損毀后的變形鳴曲; 下圖為右側DM損毀后的變異鳴曲。正常狀態下雄性的自鳴曲的序幕音(i) 一～多個, 相同或不同的音節(s)尾隨其后成串地出現, 每個音節間距緊密而穩定, 相同的音節時程也相對固定, 單個音節內富含復雜而有規律的頻率調制, 基頻和高頻都十分穩定, 這些都是成熟鳴曲所具有的特征。損毀右側RA核團后, 仍然可見成串的聲音信號發出, 即鳴曲的序列沒有受影響,但鳴曲內的音節出現較大變化, 表現為時程顯著縮短; 結構由原本復雜且有調頻變成簡單得近似于恒頻, 且諧波模糊; 主能量帶拓寬且界限不清晰。對鳴曲中音節的基頻和高頻進行分析, 發現當右側RA損毀后基頻失去穩定, 當右側 DM 損毀后基頻出現上移, 幅度為66%(圖6A); 相反, 當右側RA損毀后, 音節頻率高端缺失 22%, 由原來的(20 282.82±261.56) Hz降至(15 859.67±402.52) Hz, 繼RA后損毀右側 DM核團, 音節頻率高端再次下降12%, 降至(13 993.81±1 017.67) Hz, 兩次手術后音節頻率高端降幅達34%(圖6B)。

2.4 組織學檢驗

采集完每個階段的聲音信號后(約兩周), 所有的實驗鳥需經灌流后取腦, 將腦切片后進行尼氏染色, 檢驗損毀位點, 當組織學與行為學結果一致時則判定為有效數據再進行分析統計。

圖6 右側損毀影響鳴曲音節基頻和高頻的穩定性Figure 6 Changes in fundamental frequency and high frequencyof syllables before and after right side nuclei lesionA：術前基頻穩定, RA被損后基頻變化不明顯, DM被損后基頻顯著上揚; B：術前高頻較高且穩定, RA被損后高頻顯明下降, DM被損后高頻再次下降。A: fundamental frequency was steady before the operation, did not vary after RA was destroyed, but showed significant uptrend after DM lesion; B:before operation male birds had a steady and higher high frequency, which significantly descended after RA lesion and again after DM lesion.

3 討 論

斑胸草雀鳴唱行為呈性別二態性, 雄鳥通過幼齡期學習能產生復雜多變的習得性發聲, 而雌鳥只能發出非習得性的簡單鳴叫, 與此對應的控制發聲的神經系統亦有明顯的性別二態性, 雄鳥腦內的發聲核團明顯大于雌鳥(Bottjer et al, 1997; MacDougall-Shackleton & Ball, 1999; Li & Li, 1999)。神經解剖與電生理實驗也發現雌性腦內的核團間聯系也較雄性少很多(Fukushima & Aoki, 2002)。雄鳥如不經過學習教習曲或端腦功能缺陷也不能發出帶有雄性特征的聲音。

3.1 長鳴

Vicario et al (2001)通過損毀雙側RA核團后分析成年雄性斑胸草雀長鳴的變化及其對聲音刺激的反應。損毀前, 雄鳥發出的是雄性特征的長鳴,即有較高且穩定的基頻、相對較短的時程并伴有快速調頻特性; 一些雄鳥對雌雄同類聲音的刺激反應差別較大, 雌鳥的聲音能刺激其發出較多的長鳴。而損毀后, 雄鳥聲音發生變異, 出現了鳴叫時程延長和快速調頻特性的喪失。另外, 雄鳥對雌雄同類聲音的刺激也不再出現差別反應。我們損毀斑胸草雀右側RA后所得的聲學結果與Vicario et al的報道相似, 共同支持習得性發聲由前腦核團控制產生的觀點(Simpson & Vicario, 1990); 但值得一提的是,從本研究的結果得知, 損毀右側 RA后, 長鳴時域和頻域發生顯著變化, 而損毀左側RA對長鳴幾乎沒有影響。鳴禽與人類相似, 其發聲中樞存在側別優勢, 多數鳴禽的發聲呈左腦優勢, 而斑胸草雀的鳴叫中樞呈右腦優勢(Nottebohm & Nottebohm,1976; Li & Qin, 2009), 所以, 我們認為是右側高位中樞指導習得性聲音的產生。

除前腦高級中樞外, 中腦的基本中樞對習得性發聲也有重要影響。過去認為, 中腦、延髓的發聲相關核團參與無性別差別的本能發聲, 不參與復雜的習得性發聲。但實驗表明, 刺激延髓的呼吸核團也能造成類似刺激高級發聲中樞所產生的發聲干擾。另外, 對于中腦 DM 核團而言, 它接受丘間核復合體抑制性信號的輸入, 是兩性鳴禽均能發出長鳴的關鍵結構, 雄鳥的DM接受來自同側RA的突觸輸入, 這一條路徑已被證實為屬于發聲通路的一部分(Ashmore et al, 2005), 所以, 雄鳥DM核團在神經環路和功能上都有別于雌鳥的DM核團。我們的研究表明, 損毀右側 DM 后, 長鳴的某些聲學參數仍在發生變化, 說明DM核團參與習得性發聲的調節。

RA部分投射神經元與呼吸網絡(由DM、RAm、PAm核團組成)構成聯系(Ashmore et al, 2005), DM核團本身為呼吸網絡的一部分, 由此可知呼吸控制相關核團受高級中樞支配, 當 RA被損毀后, 呼吸網絡失去高位調節而引起呼吸紊亂, 從而造成發聲時程延長, 如口吃一般。DM 核團既作為發聲通路中的一部分又作為呼吸網絡的一部分, 它對發聲與呼吸的影響至關重要, 它的缺失亦對發聲時程造成顯著延長。實驗表明, 刺激兩性鳴禽的DM核團能誘發出類似長距鳴叫的叫聲, 誘發叫聲的時程取決于刺激的脈沖數。隨刺激脈沖數增加, 叫聲時程相對較長, 反之則短。這說明在性成熟的兩性鳴禽中,DM核團中的神經系統可能控制著長距鳴叫的時程(Fukushima & Aoki, 2002)。

3.2 鳴曲

損毀右側RA核團和DM核團后鳴曲出現變化,與長鳴的變化不同。第一次損毀后, 鳴曲立即發生變化, 鳴曲中音節的頻率變化類似于長鳴的頻率變化, 聲音結構由復雜變簡單, 調頻特性消失, 音節趨于恒頻, 聲色暗啞沒有起伏。術前音節的高低頻穩定, 能量帶清晰, 高端頻率可＞20 kHz, 基低也較為穩定, 第一次手術后(RA核團的損毀), 音節結構已出現上述頻率特征的改變, 能量帶界線不清,高端頻率出現顯著下降, 只達到～15 kHz, 單個音節時程縮短, 每個音節相似; 第二次手術后(DM 核團的損毀), 語圖中的音節更模糊, 高端再次有所下降, 降到～13 kHz, 基頻也開始不穩定, 出現飄移。

調控鳴曲變異的因素有很多, 前運動核團HVC和RA的神經元在產生鳴唱時同時激活, 支配鳴管發聲。社會情境對成年鳴曲的序列和音節可變性也有調節作用(Sakata et al, 2008)。幼齡期前端腦通路助于鳴曲的形成。正如我們所提到, 鳴曲是成串的聲音信號, 某一次的發聲機會中, 鳴禽可能發出一次長鳴或一首鳴曲, 控聲核團被損毀后, 雖然單個音節時程縮短了, 但整首鳴曲的時程可能延長,音節數量可能增加, 這與呼吸失調是相關聯的。另外, 鳴曲的編碼, 如序列及節奏等是HVC與腦干中有神經折返回前腦的核團所共同作用而產生, 所以,我們推測不損及 HVC和腦干的情況下, 鳴曲的改變更多在于音節的改變。此外, 右側實驗組的鳴曲較為重大的變化是高低端頻率的缺失, 這個現象在中腦核團被損后猶為突出, 這與刺激中腦DM時所記錄的發聲相似, 即基頻升高, 高頻下降, 所以,我們推測中腦在調控音節的高低頻中起著關鍵作用。