與多花黑麥草株高性狀相關的RAPD標記分析

張曉佩 高承芳 李文楊 劉 遠 董曉寧

（福建省農業科學院畜牧獸醫研究所 福州 350013）

多花黑麥草（Lolium multiflorum）又名意大利黑麥草、一年生黑麥草，是一年生或者越年生禾本科植物，原產地中海沿岸[1]，是優良的牧草和草坪草。作為牧草具有生長快、產草量高、營養價值高、適口性好等優點，適用于飼喂各種畜、禽、魚。它也可以作為先鋒草種和保護草種用于草坪。近年來，多花黑麥草在我國栽培的面積日益擴大，尤其是在我國長江流域及其以南地區。

RAPD標記技術已經廣泛用于植物的遺傳多樣性、圖譜構建、品種鑒定、基因定位、分子標記輔助育種等研究[2-3]。目前RAPD標記技術主要用于多花黑麥草遺傳多樣性和品種資源研究[4-6]。本研究初次進行與株高性狀相關的RAPD標記分析，旨在為多花黑麥草育種提供分子學方面的基本資料。

1 材料與方法

1.1 材料 選用多花黑麥草品種資源4份：美克斯、?？死锼?、劍寶和特高，由百綠公司北京分公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 基因組DNA提取采用改進CTAB法[7]，最后測基因組DNA濃度，并用0.1×TE稀釋到終濃度100 ng/mL。放在-20℃的冰箱中保存備用。

按照每個品種取25個個體DNA的數量，經過測DNA濃度后，稀釋成等濃度后等量混合，制成品種的混合DNA（池DNA），用隨機引物進行擴增分析。

1.2.2 株高數據記錄 黑麥草的株高數據來自試驗田記錄（取群體均值）。株高測量方法：測定地面到最高葉片尖端的垂直高度。在出苗后生長第60 d（即營養生長期），每個品種隨機取20株測量垂直高度，植株各垂直高度的算術平均值為測定植株的高度。1.2.3 RAPD擴增及檢測 從110條隨機引物中篩選出68條，用該68條隨機引物分別對4個黑麥草品種進行PCR擴增，最后篩選出23條多態性高、重復性好的隨機引物（如表1），對所有的4個黑麥草品種進行PCR擴增，PCR反應體系為 20μL：10×buffer 2.0 μL，MgC122.0 μL，25 mmo1/L dNTP 2.0 μL，TaqDNA聚合酶1 U，引物1μL，總DNA 100 ng和ddH2O 12μL。擴增反應程序為95℃預變性5 min，然后進入循環，每個循環為95℃變性1 min，36℃退火2 min，72℃延伸1.5 min，共46個循環，最后72℃再延伸10 min。反應產物在1.5%瓊脂糖凝膠上檢測，電壓120 V，電泳25 min，用BIO-RAD Ge1 Doc 2000凝膠成像系統記錄拍照。

1.2.4 數據分析 同一引物擴增產物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性，屬于同一位點的產物按擴增陽性（1）或擴增陰性（2）記錄電泳帶譜，利用SASSystem進行多態性標記的t檢驗，以獲得與株高性狀緊密連鎖的分子標記，顯著水準P＜0.05。多態頻率用多態帶數目與擴增出所有主帶的比率表示。

2 結果分析與討論

2.1 引物篩選與RAPD擴增結果 最后用于4種多花黑麥草基因組DNA的RAPD擴增的23條引物擴增結果重復率高、擴增條帶多態性好，擴增結果見表1、圖1。不同引物和不同多花黑麥草品種基因組DNA引起擴增的條帶數目不同，數目變化在4～12個，多態性位點的比例為75%～100%?？傊?，從110條中篩選出的23條引物，共擴增出174條帶，其中多態性條帶有166個，因此，多態性位點占的比例是95.4%。結果說明，多花黑麥草基因組DNA多態性非常豐富。

2.2 與株高性狀相關性分析 把研究群體按照標記基因型的種類不同分成兩種類型，即1型和2型，對不同標記基因型的株高性狀進行方差分析，得到株高性狀與多個標記之間的相關值。方差分析結果表明：在23條引物中有6條特異性標記條帶，分布在5條引物中，與多花黑麥草的株高性狀呈現出顯著相關（P ＜0.05）。從表 2中可以看出：S04-6、S15-3、S50-5、S50-8、S67-2、S99-7 等 6 條特異性標記帶與多花黑麥草株高性狀有著顯著的相關。

表1 引物序列和擴增結果

圖1 部分引物擴增結果

由以上結果可以看出，研究中用23條引物共擴增了166個特異性條帶，但經過t檢驗，與目標性狀(株高)相關的標記僅有6個，說明166個特異性條帶所代表的位點控制著更多的性狀，并不僅限于株高。

表2 RAPD標記類型與株高的關聯分析

從t檢驗結果可以看出，6個標記中有基因1型大于基因2型的，也有基因2型大于基因1型的，說明對多花黑麥草株高性狀來講，有3個標記是增效的，有3個標記是減效的。選擇有增效標記的個體留種可以增加選種的準確性，加快黑麥草育種的進程，因此，這些分子標記輔助選擇育種對于黑麥草的育種十分有意義。

3 小結

1）用基因組DNA作RAPD檢測多花黑麥草株高性狀位點的方法是可行的，本研究篩選出了23個隨機引物對4個多花黑麥草品種的基因組DNA進行擴增，共得到174條帶，其中166條帶為多態性條帶，標記率為95.4%。

2）用RAPD技術檢測出了4個多花黑麥草品種基因組DNA的6個株高性狀的標記（分布在5條引物中），它們是 S04-6、S15-3、S50-5、S50-8、S67-2、S99-7等。

[1] Ca11ow M,Miche H,et a1.The effect of defo1iation practice in western Ausa1ia on ti11er deve1opment of Annua1 Ryegrass(Lo1ium rigidum)and Ita1ian ryegrass(Lo1ium mu1tif1omm)and its association with forage qua1ity[J].Gass and Frage Science,2000,55:232-241.

[2] 黃艷霞,白昌軍.分子標記技術及在牧草中的應用[J].熱帶農業科學,2008,28(4):81-85.

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[4] 寧婷婷,張再君,金誠贊,等.用RAPD分析多年生黑麥草品種間遺傳多樣性[J].武漢植物學研究,2005,23(1):27-31.

[5] 李杰勤,王麗華,詹秋文,等.不同黑麥草及其近緣種高羊茅的RAPD多態性分析[J].種子,2007,26(11):21-23.

[6] 王學奎.植物生理生化實驗原理和技術[M].2版.北京:高等教育出版社,2006:180-182.

[7] 邱永福,田志宏,楊曉松.冷季型草坪草基因組DNA的提取方法比較[J].長江大學學報:自然科學版,2005,2(2):28-30.