兒童急性淋巴細胞白血病骨髓細胞形態學檢查多中心綜合比較及評價

張 雪，李 蓓，陳振萍，吳敏媛，李志剛

(1.兒童血液病與腫瘤分子分型北京市重點實驗室、兒科學國家重點學科、教育部兒科重大疾病研究重點實驗室、首都醫科大學附屬北京兒童醫院血液腫瘤中心，北京100045;2.首都醫科大學附屬北京兒童醫院科研處，北京100045)

骨髓細胞形態學檢查因其方法簡單、報告及時、參考價值大，在血液系統疾病診斷中發揮著相當關鍵的作用。但是在多數情況下，由于骨髓取材過程、染色、檢驗人員判定能力以及所用術語習慣的不同，使這項診斷技術缺乏統一的標準，特別是在一些惡性血液系統疾病的診斷、治療中，更需要進一步規范。

急性白血病(acute leukemia，AL)是兒童最常見的惡性腫瘤，其中急性淋巴細胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)約占兒童 AL的70%[1]。目前，ALL多采用 MIC(細胞形態學、免疫學、細胞遺傳學)分型法。其中骨髓細胞形態學診斷因不受實驗室規模和儀器限制，往往作為ALL診斷的首選項目，同時也是ALL后續治療評估、調整治療方案的重要依據之一。但是，骨髓細胞形態學檢查作為一項特殊性檢驗項目，影響因素相對較多，同時對檢驗人員的素質、能力要求比較嚴格、苛刻。因此其客觀性往往不如免疫學和細胞遺傳學檢查。

2008年，由首都醫科大學附屬北京兒童醫院、中國醫學科學院北京協和醫學院血液病醫院、香港威爾斯親王醫院、蘇州大學附屬兒童醫院等全國13家醫院以及首都醫科大學共同組成了中國兒童白血病協作組(Chinese Children's Leukemia Group，CCLG)，研究兒童 ALL 診斷、規范性治療及預后評估。該項目的重要內容之一就是完善并統一兒童ALL在細胞形態學的診斷及評估標準。

材料和方法

一、研究對象

CCLG的13家成員醫院于2008年1月至2010年12月期間共收治1 091例ALL患兒，其中男童653例，女童438例，中位年齡4歲(0.5～16歲)。協作組成員醫院對ALL患兒采用統一的入組標準[2]，其中標危組 480 例(44.0%)、中危組395例(36.2%)、高危組 216 例(19.8%)。ALL患兒治療期間統一使用CCLG-ALL2008治療方案[2]。所有病例的中位隨訪時間為18個月(0.4個月 ～36個月)。

二、研究方法

1.建立多中心協作的資料采集、登記、共享的網絡信息管理系統。

2.經過CCLG各成員醫院協商，通過網絡信息管理系統，使用單純隨機抽樣方法，分別從標危組、中危組、高危組抽取10%樣本，其中，標危組48例、中危組40例、高危組22例，共計110例。登記被抽樣ALL患兒資料，包括姓名、性別、年齡、收治醫院、入院時間。

3.將被抽樣患兒資料反饋給其收治醫院，同時依據CCLG-ALL2008治療方案規定的骨髓檢查時間，要求該醫院提供該患兒的初診、治療第15天、治療第33天以及治療第12周的骨髓細胞涂片及相對應的原始報告。

4.由專人接收、登記各醫院復檢骨髓細胞涂片及原始報告，并將復檢骨髓細胞涂片及原始報告統一登記管理。

5.采用電腦隨機派位方法，將骨髓細胞涂片平均分配給2名檢驗人員進行復檢，復檢內容包括骨髓細胞分類(CCLG各成員醫院均計數200個有核細胞)、描述骨髓像特點、提出檢驗結論。復檢人員均專職負責骨髓細胞涂片檢查，且均為中級技術職稱。

6.由血液專業臨床醫師和檢驗技師各一名，對骨髓細胞涂片復檢報告和原始報告進行審核、比對、分析，并提供書面意見。

7.將骨髓細胞涂片、復檢報告以及反饋意見發還給CCLG各成員醫院。

結 果

一、骨髓取材及增生程度判斷

在隨機抽取的110個樣本共440份骨髓細胞涂片中有12份(2.7%)骨髓細胞涂片復檢報告與原始報告均判斷取材稀釋，且均未描述骨髓增生程度，其中治療第15天骨髓細胞涂片7份(1.6%)、治療第 33天骨髓細胞涂片 5份(1.1%)。13 份(3.0%)骨髓細胞涂片復檢報告判斷骨髓取材稀釋，未描述骨髓增生程度;而原始報告判斷該13份骨髓細胞涂片取材良好，均描述骨髓增生減低，其中治療第15天骨髓細胞涂片7份(1.6%)，治療第 33天骨髓細胞涂片 6份(1.4%)。其余 415 份(94.3%)骨髓細胞涂片復檢報告與原始報告均判斷骨髓取材良好，其骨髓增生程度描述也基本吻合。報告存在分歧的13份骨髓細胞涂片，經過復審，支持復檢報告結論。

二、染色情況

復檢報告中有7份(1.6%)初診骨髓細胞涂片描述染色偏淺，5份(1.1%)初診骨髓細胞涂片描述染色偏深;這12份骨髓細胞涂片原始報告均描述染色良好。其余428份(97.3%)骨髓細胞涂片的復檢報告與原始報告均描述染色良好。報告存在分歧的12份骨髓細胞涂片經過復審，支持復檢報告結論。

三、骨髓像特點描述

復檢報告與原始報告描述骨髓像特點時均不同程度存在使用語言不規范，名詞術語使用不統一，中、英文混用以及使用不規范的縮略語或英文縮寫等現象。同時，各CCLG成員醫院骨髓細胞形態學檢驗報告格式不統一。

表1 兒童ALL初診及治療期間骨髓細胞涂片復檢與原始報告符合情況統計 [份(%)]

四、檢驗結論

除骨髓取材情況存在異議的骨髓細胞涂片以及稀釋骨髓細胞涂片復檢報告及原始報告均建議復查、未下檢驗結論外，其余415份(94.3%)骨髓細胞涂片復檢報告與原始報告檢驗結論基本吻合。其中110份初診骨髓細胞涂片檢驗結論均為ALL;在96份ALL治療第15天骨髓細胞涂片中，76份(79.2%)診斷為完全緩解(CR)、13份(13.5%)診斷為部分緩解(PR)、7 份(7.3%)診斷為未緩解(NR);在99份ALL治療第33天骨髓細胞涂片中，93份(93.9%)診斷為 CR、4份(4.0%)診斷為 PR、2 份(2.0%)診斷為 NR;在110份ALL治療第12周骨髓細胞涂片中，109份(99.1%)診斷為 CR、1 份(0.9%)診斷為骨髓復發。

表2 兒童ALL骨髓復檢與原始報告緩解情況符合統計 [份(%)]

討 論

世界衛生組織(WHO)新的分型系統強調了形態學在血液系統疾病診斷的重要性。特別是在急性白血病的分型和治療評估中，骨髓細胞形態學檢查更具有重要的參考價值和意義[3]。CCLG各成員醫院骨髓細胞涂片的制作和常規染色比較統一，沒有特殊或改良方法。但是在日常工作中，由于工作人員在實際操作中存在技術和習慣性差異，可能造成骨髓細胞在取材、制片及染色過程中出現與理論要求不同;同時，由于檢驗人員的細胞辨別能力以及細胞形態術語應用習慣的差異，影響了骨髓細胞形態學診斷的客觀性和一致性，使這項診斷技術缺乏標準化，在跨地區、跨醫院進行骨髓細胞涂片會診中出現檢驗結論偏差。因此，多中心進行骨髓細胞涂片的室間比對在統一骨髓細胞形態學檢驗方法，提高實驗室骨髓細胞形態學檢驗水平的同時，通過討論和協商，建立統一的骨髓細胞形態檢驗標準及報告格式，為多中心協作發展和血液系統及相關疾病的病例會診、討論提供了統一的實驗室平臺。

骨髓細胞取材是骨髓細胞學檢查的基礎，但有時骨髓穿刺采集標本時?；煅♂?，影響骨髓細胞學檢查結果。因此，鑒別稀釋骨髓細胞涂片是能否正確診斷血液系統疾病的前提。但是，目前《全國臨床檢驗操作規程》等有關文獻都未明確提及骨髓細胞涂片稀釋的判斷標準。因此，在實際工作中往往憑借檢驗人員的經驗判斷，易造成偏差。特別是在兒童ALL治療第15天和治療第33天期間，其骨髓增生受到化療藥物抑制，骨髓穿刺時易出現骨髓干抽，造成骨髓稀釋現象，而稀釋骨髓細胞涂片中白血病細胞比值常少于取材良好的骨髓細胞涂片。因此，正確判斷骨髓稀釋與骨髓抑制期的骨髓增生減低是評估ALL患兒治療效果，繼續或調整治療方案的重要保證。本研究中有13份骨髓細胞涂片原始報告判斷骨髓增生減低，但復檢報告判斷骨髓稀釋，而這13份標本均為治療第15天或治療第33天骨髓。另外，有12份骨髓細胞涂片復檢報告與原始報告均判斷為骨髓稀釋，這12份標本也均為治療第15天或治療第33天骨髓。因此，鑒別骨髓細胞涂片是否稀釋需要檢驗人員長期的經驗積累和對該疾病以及該疾病治療期間骨髓特點的準確認識和把握。同時，多部位骨髓穿刺取材也是鑒別骨髓抑制或骨髓稀釋的方法，但對患者創傷較大，操作時應慎重。

本研究中除12份稀釋骨髓細胞涂片和13份骨髓取材情況有異議的骨髓細胞涂片外，其余415份骨髓細胞涂片增生程度的判斷非常吻合。目前，對骨髓增生程度的分級標準[4-5]已經非常明確，一般采用五級分級法[5]。即使對于骨髓細胞形態初學者也可以參照分級標準對骨髓增生程度進行正確判斷。但是，對于稀釋骨髓細胞涂片不應進行增生程度分級，但應對骨髓稀釋程度進行適當說明或描述。

骨髓細胞涂片染色目前多采用Wright染液或Wright-Giemsa混合染液[6]染色，方法均比較成熟。本研究中原始報告對骨髓細胞涂片染色均描述染色良好，但在復檢報告中出現ALL患兒初診骨髓細胞涂片染色偏淺或偏深現象。骨髓細胞涂片染色情況直接影響檢驗人員對骨髓細胞的辨別。因此，當不能把握染色過程中細胞著色程度時，應在涂片染色過程中使用顯微鏡低倍鏡反復、多次觀察涂片中有核細胞染色情況。當有核細胞染色略深于正常顏色時方可沖去染液。同時，骨髓細胞涂片染色時間應結合涂片中有核細胞數量、染液與緩沖液比例、實驗室溫度等因素靈活掌握，不能一概而論。ALL患兒初診骨髓細胞涂片中有核細胞相對較多，造成染色時間掌握不準確，使有核細胞著色不好。

CCLG各成員醫院由于各實驗室骨髓細胞學檢查電腦軟件操作平臺不同，同時各醫院對骨髓細胞形態學檢驗報告要求存在差異，檢驗人員對骨髓像描述習慣不同，在骨髓細胞涂片檢查中往往存在報告內容不統一，描述骨髓像特點時專業術語使用不規范等現象，例如在描述骨髓增生程度時出現“Ⅰ～Ⅴ級”分級和“增生極度活躍、明顯活躍、活躍、減低和極度減低”分級兩種描述方法;另外，還存在部分細胞形態特點描述不一致，中文命名不統一，中、英文混用以及使用不規范中文縮略語或英文縮寫等現象。這些問題說明細胞形態學領域需要達成必要的共識，這將有助于提高骨髓細胞形態學診斷綜合水平，同時對于跨地區、跨醫院骨髓細胞涂片會診提供統一、規范的標準。

目前，骨髓細胞形態學的方法學已經相當成熟。但在實際操作中，由于骨髓細胞形態學檢驗專職人員相對較少，而細胞形態學本身具有專業性、經驗性強和有一定傳承性的特點。同時，檢驗人員對骨髓各階段細胞形態尺度及標準的把握，對疾病發生、發展過程中骨髓特點的掌握均不同程度的影響檢驗結論，造成骨髓細胞涂片在會診過程中結論出現差異。因此，要提高骨髓細胞形態學診斷水平就需要完全依靠檢驗人員扎實的理論基礎和長期工作經驗的積累，這也是血液實驗室管理中的重點、難點[7]。同時，實驗室間定期交流比對、實驗室內部對疑難細胞涂片討論學習、檢驗人員的定期培訓和考核[8]以及積極參加骨髓讀片會都是提高實驗室檢驗水平、強化檢驗人員綜合素質、統一實驗室診斷標準的必要手段和方法。

本研究僅對CCLG成員醫院兒童ALL骨髓細胞涂片檢查進行比較評價，存在一定局限性，而對于其它疾病的骨髓細胞形態學檢查還需要各醫院實驗室間進行定期比對和長期的經驗和人員交流，通過討論、協商，統一標準，最終達到各成員醫院間骨髓細胞形態學檢查結果的互認。

致謝:CCLG成員醫院(排名不分先后)為中國醫學科學院北京協和醫學院血液病醫院、香港威爾斯親王醫院、北京大學人民醫院、首都兒科研究所附屬兒童醫院、中國人民解放軍總醫院、中國人民解放軍海軍總醫院、蘇州大學附屬兒童醫院、重慶醫科大學附屬兒童醫院、華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院、哈爾濱市兒童醫院、四川大學華西醫學中心第二附屬醫院、復旦大學附屬兒科醫院。

[1]McCredie M，Williams S.Coates M.Cancer mortality in migrants from the British Isles and continental Europe to New South Wales，Australia，1975-1995[J].Int J Cancer，1999，83(2):179-185.

[2]吳敏媛，李志光，李志剛.兒童急性淋巴細胞性白血病治療策略的思考[J].中華兒科雜志，2010，48(3):161-165.

[3]Zini G，Bain B，Bettelheim P，et al.A European consensus report on blood cell identification:terminology utilized and morphological diagnosis concordance among 28 experts from 17 countries within the European Leukemia Net network WP10，on behalf of the ELN Morphology Faculty[J].Br J Haematol，2010，151(4):359-364.

[4]袁毓賢，李文成.實用血液學細胞學圖譜[M].北京:人民衛生出版社，2001:10-11.

[5]徐文榮，王建中.臨床血液學與檢驗[M].第4版.北京:人民衛生出版社，2009:64-66.

[6]Jaffe ES，Harris NL，Stein H，et al.Pathology and genetics of tumours of haematopietic and lynphoid tissues[M].Lyon:IARC Pess，2001:78.

[7]叢玉隆.ISO15189認可現場評審引發的對細胞形態學檢驗問題的思考[J].中華檢驗醫學雜志，2008，31(7):725-728.

[8]陳麗娟，何海峰，張發展.實驗室內部質量控制方法的探討[J].現代測量與實驗室管理，2008，16(4):34-35.