夏枯草硫酸多糖對肝癌血管生成的作用及機制研究*

王雅楠 曹 蕊 朱 聰 吳雄志

腫瘤的發生、生長、浸潤及轉移，不僅需要依靠腫瘤細胞自身具有的生物學增殖活性，而且更加依賴于從宿主環境中汲取氧分和營養物質［1］。當腫瘤體積達到1～2 mm3時，腫瘤呈現出血管生成表像并從周圍基質中發生新生血管［2］。腫瘤的新生血管形成可以給腫瘤的發生、生長提供所需要的氧氣以及營養物質，而且血管可以作為腫瘤細胞發生遠處轉移的通道。所以抑制腫瘤血管生成作為一個研究熱點，引起熱議。其中，一些蛋白的表達如堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和白介素8（interleukin-8，IL-8）作為腫瘤生長過程中刺激血管生成的因子，受到了廣泛的關注［3-5］。

bFGF發揮其生物學活性需要兩種受體的參與，首先bFGF同細胞外間質中的低親和力受體硫酸肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPG）結合，然后進一步與位于細胞表面的酪氨酸特異性FGF受體（FGF receptor，FGFR）結合形成FGF/HSPG/FGFR三聚體復合物，從而進行信號傳導。含有硫酸基的多糖為HSPG的結構類似物，故從理論上來說，此類多糖能夠同HSPG競爭性的結合bFGF，從而阻止FGFPG/HSPG/FGFR三聚體復合物形成，抑制bFGF發揮其生物學活性［6］。

夏枯草硫酸多糖（P.vulgaris sulfated polysaccharide，PVSP）是從夏枯草中提取出來的重要的抗腫瘤成分，屬于含有硫酸基的多糖［7］。香菇多糖（Lentinan，LNT）是香菇的活性成分，具有抗腫瘤和免疫調節作用，是不含有硫酸基的多糖［8］。近年研究證實一種新型的硫酸多糖-守宮硫酸糖肽能夠抑制bFGF進而抑制肝癌血管生成［3］。所以本實驗意在探究含有硫酸基的PVSP是否也對肝癌細胞中腫瘤血管生成因子的表達以及肝癌血管生成有影響。為進一步說明PVSP在血管生成中的作用，本實驗用不含硫酸基的LNT作為陰性對照，同PVSP進行對比研究。

1 材料與方法

1.1 主要的材料和試劑

PVSP和LNT購于南京澤朗醫藥科技有限公司；bFGF、VEGF、IL-8酶聯免疫試劑盒購于R＆B公司；CD34購于Abcam公司。人肝癌細胞株HepG2和Bel-7402來源于天津醫科大學腫瘤研究所。Nu/Nu裸鼠（4～6周齡，雌性）購于中國醫學科學院，動物實驗遵循國家衛生研究院動物保健指南的規范與準則。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及藥物處理 HepG2細胞和Bel-7402細胞加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，當細胞鋪滿瓶壁80%時傳代。

1.2.2 ELISA法測量PVSP對血管生成因子bFGF、VEGF、IL-8分泌的影響 取對數生長期的HepG2細胞，以5×104個細胞/孔鋪于12孔板中，每孔加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，孵育24 h。用含10%血清的DMEM培養液將PVSP和LNT配制成終濃度為10、100、200 μg/mL的培養液，12孔板中加入2 mL不同濃度的藥物，空白對照組加入2 mL普通細胞培養液。每個藥物濃度設3個平行復孔，繼續培養。于72 h后收集每組藥物濃度的細胞懸液按照ELISA試劑盒中相關說明來進行血管生成因子bFGF、VEGF、IL-8蛋白的測定。

1.2.3 異種移植模型建立 應用Bel-7402人肝癌細胞株（0.1 mL，8×106個），在20只Nu/Nu裸小鼠（雌性，4～6周齡）鼠皮下注射建立人肝癌裸小鼠皮下移植瘤模型。藥物處理在注射細胞后的第二天進行。將裸鼠隨機分成4組后開始給予治療，各組具體的治療方案如下：1）生理鹽水組；2）10 mg/kgLNT組；3）20 mg/kg PVSP組；4）200 mg/kg PVSP組。藥物每天注射1次，直到25d后將裸鼠處死。

1.2.4 微血管密度（microvessels density，MVD）的測量 分離各組小鼠的腫瘤組織，10%中性甲醛固定，石蠟包埋并切片（4 μm），行CD34分子的免疫組織化學染色，所用一抗為大鼠抗小鼠CD34單克隆抗體（1:10）。腫瘤微血管密度的計數方法為：計數CD34單克隆抗體陽性的微血管，先用低倍鏡掃視整個切片，尋找MVD密度最高的區域，然后在400倍的視野下分別計數腫物中心及腫物邊緣的微血管數，共計數5個視野，取平均值來作為該例的MVD。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 PVSP對HepG2細胞bFGF分泌的影響

10、100、200 μg/mL的PVSP作用時，HepG2細胞分泌的bFGF水平分別為（1 163.22±123.89）、（1 103.22±124.74）pg/mL和（574.67±70.24）pg/mL，即隨著夏枯草濃度增高，bFGF分泌水平逐漸降低。同空白對照組bFGF的濃度（1018.78±75.15）pg/mL相比，200 μg/mL的PVSP對bFGF分泌具有抑制作用，其抑制率為43.60%（P＜0.01）。10、100、200 μg/mL的LNT作用后細胞分泌bFGF的水平同空白對照相比沒有統計學差異（P＞0.05，表1）。

2.2 PVSP對HepG2細胞VEGF和IL-8分泌的影響

各個劑量的PVSP對VEGF和IL-8的分泌同和LNT對照組以及PBS對照組相比均無統計學差異（P＞0.05，表1）。

表1 PVSP對HepG2細胞bFGF、VEGF和IL-8分泌的影響Table 1 Effects of PVSP on the secretions of bFGF,VEGF,and IL-8 in HepG2 cells

表1 PVSP對HepG2細胞bFGF、VEGF和IL-8分泌的影響（續表1）Table 1 Effects of PVSP on the secretions of bFGF,VEGF,and IL-8 in HepG2 cells

2.3 PVSP對肝癌組織中MVD的影響

空白對照組中MVD的平均值為（14.80±4.26）個/高倍視野，MVD在PVSP 200 mg/kg作用時的平均值為（7.27±1.55）個/高倍視野，故PVSP200 mg/kg能夠抑制肝癌組織中微血管形成，其抑制率為50.88%（P=0.03），而PVSP20mg/kg和LNT10 mg/kg均不能夠抑制肝癌組織中微血管的形成（P＞0.05，表2，圖1）。

表2 體內實驗中PVSP抑制腫瘤血管生成Table 2 PVSP inhibited tumor angiogenesis in vivo

圖1 PVSP抑制腫瘤血管生成（箭頭顯示CD34陽性的血管，微血管密度計數在400倍視野下進行）Figure 1 PVSP inhibited tumor angiogenesis in vivo.The number of CD34-positive blood vessels was counted.MVD is counted in the 400×field

3 討論

原發性肝癌是全球發病率較高的惡性腫瘤之一，居全球惡性腫瘤發病的第六位，由肝癌引起的死亡據全球腫瘤相關死亡的第三位［9］。肝癌是一種典型的富血管惡性腫瘤，惡性程度高，轉移率高和復發率高是影響其預后的主要因素［10-11］。肝癌的血管生成與其生長、浸潤、轉移及預后有著密切聯系，對肝癌的血管生成抑制劑的研究是臨床治療肝癌的研究熱點。血管生成因子如bFGF、VEGF和IL-8對血管生成有著至關重要的作用，抑制血管生成因子的分泌有助于抑制腫瘤的血管生成。VEGF為一種有效的促血管形成和增加血管通透性的誘導因子，針對VEGF或其受體治療肝癌的靶向藥物如貝伐單抗，索拉非尼等都已進入臨床進行應用［12］。不同于VEGF，bFGF和IL-8對于血管生成的研究以及藥物治療尚處于實驗階段。

含有硫酸基的多糖為HSPG的結構類似物，因此這類多糖能夠同HSPG競爭性結合bFGF從而阻斷bFGF促進血管生成的活性。先前的研究證明守宮硫酸糖肽能夠通過抑制bFGF與受體結合從而發揮其抑制血管生成的作用［3］。PVSP為夏枯草的水提取物。研究證實同守宮硫酸糖肽類似，PVSP同樣能夠與HSPG競爭性的結合bFGF，阻止受體三元體形成，進而抑制bFGF誘導的血管內皮細胞增殖、凋亡和遷移［13］?？梢娨种芺FGF受體結合是含有硫酸基的多糖類藥物的共性。

然而硫酸多糖與bFGF分泌的關系缺少深入研究。已有研究證明守宮硫酸糖肽能夠通過抑制bFGF的轉錄因子Egr-1的表達從而抑制bFGF分泌，但是同為硫酸多糖類藥物的褐藻卻不能夠抑制bFGF的分泌［3，14］。筆者的研究結果表明高劑量的PVSP能夠抑制肝癌bFGF的分泌，這說明對于血管內皮細胞生長因子bFGF來說PVSP不僅能夠阻止bFGF受體三元體形成，而且能夠抑制bFGF分泌，進而發揮抑制血管內皮細胞生長的作用。PVSP對bFGF分泌的抑制作用是否同Egr-1相關，這有待于進一步驗證。

先前的研究證實，在肝癌細胞株中，守宮硫酸糖肽能夠降低IL-8的分泌從而抑制細胞遷移［15］。同守宮硫酸糖肽不同，PVSP對于IL-8的分泌沒有影響，因此PVSP不能抑制由IL-8誘導的微血管內皮細胞的轉移和增殖。

筆者對體內的研究進一步證實，PVSP對MVD具有抑制作用，進而發揮抑制肝癌組織中微血管生成的作用。綜上所述，PVSP具有對肝癌血管生成的抑制作用，值得進一步研究開發。

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