響應面試驗優化綠豆凝集素提取工藝

黃澤華，王倩雯，張 賀，李育楠，李慶波，曹龍奎,2,*

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省農產品加工工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319）

響應面試驗優化綠豆凝集素提取工藝

黃澤華1，王倩雯1，張 賀1，李育楠1，李慶波1，曹龍奎1,2,*

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省農產品加工工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319）

凝血法檢測綠豆凝集素活性，并改進凝集活性檢測兔血紅細胞處理條件，在單因素試驗的基礎上設 計響應面Box-Behnken試驗，優化綠豆凝集素提取工藝條件。結果表明，凝集活性檢測兔血紅細胞的處理最佳條件為戊二醛體積分數0.15%、25 ℃處理血細胞20 min；胰蛋白酶添加量25 U/mL、25 ℃處理1 5 min，優化條件下提高了兔血紅細胞凝集靈敏度且延長了兔血紅細胞保存時間。磷酸鹽緩沖溶液為綠豆凝集素最佳浸提溶液，綠豆凝集素優化工藝條件為料液比1∶9.09（g/mL）、NaCl濃度0.3 mol/ L、浸提時間4.16 h，在此條件下最大綠豆凝集素比活力預測和驗證值分別為134.91 U/mg和139.02 U/mg。

綠豆凝集素；響應面法；優化；提取

綠豆凝集素具有細胞凝集作用[1]，新鮮兔血紅細胞凝血法檢測的可重復性差，對紅 細胞進行戊二醛固定、胰蛋白酶處理，可以提高紅細胞的感受性和穩定性，從而增加檢測的靈敏度和可重復性[2]。綠豆凝集素是由4 個亞基構成四聚體的糖蛋白，分子質量約為160 kD，是綠豆中主要的抗營養因子之一，由Charles等[3]分離得到。飽和硫酸銨沉淀[4]、羧甲基纖維素離子交換層析[5]和凝膠過濾[6]是綠豆凝集素的純品制備的主要方法，但是這種方法采用了兩次層析步驟，分離效率低，造成大量凝集素活性損失，成本高并且耗時。純化手段的不足限制了凝集素在生物學[7]、醫學[8]和動物營養學[9]等領域的應用，因此需要尋找新的簡便且可整合的分離純化凝集素的方法。本研究采用響應面法優化了綠豆凝集素的提取工藝，并用硫酸銨雙重鹽析的方法取代一步層析操作，減小了凝集素活性的損失，起到了很好的純化效果并降低了成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆 大連白樺糧谷加工有限公司；兔血為健康成年大白兔耳緣靜脈血；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 遼寧泉瑞試劑有限公司；戊二醛50%溶液 上海生化試劑公司；胰蛋白酶 上海原葉生物科技有限公司；硫酸銨天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；TD5A型離心機 長沙英太儀器有限公司；AR2100型電子天平 奧斯豪國際貿易有限公司；HD-9707電腦紫外檢測儀 上海精科實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 綠豆凝集素的凝集素活力檢測

凝血法測定綠豆凝集素活性[10]。兔血紅細胞的處理參考Turner[11]、彭建宗[12]等的報道，并改進25 ℃時戊二醛及胰蛋白酶對兔血紅細胞處理的濃度和時間，以適用于綠豆凝集素的檢測。在96 孔凝血板上系列倍比稀釋（從前一孔吸取25 μL液體，放入下一孔內，充分混合后取25 μL液體放入下一孔內，如此操作至倒數第2個孔)，每一排第一孔稀釋兩倍（21），留下每一排的最后一空，作為對照。凝集活性滴度，指在96孔凝血板上使兔血紅細胞凝集的最小稀釋倍數，2n。凝集素活力單位和比活力計算見公式（1）、（2）。

1.3.2 蛋白質含量測定

采用Lowry法，以牛血清蛋白作為標準[13]。

1.3.3 最佳浸提緩沖溶液的確定

采用0.2 mol/L、pH 7.2 磷酸鹽緩沖液浸提，0.9%生理鹽水浸提，0.1 mol/L、pH 6.0檸檬酸緩沖溶液，0.1 mol/L、pH 9.51碳酸緩沖溶液浸提以及蒸餾水在相同條件下浸提，分別測定提取液凝集活性，確定最佳提取緩沖溶液[14]。

1.3.4 綠豆凝集素浸提條件單因素試驗

依據參考文獻[15-16]，對凝集素提取過程影響較大的因素有料液比（g/mL）、NaCl濃度、浸提時間等[17]，通過實驗探討其對綠豆凝集素凝集凝集活性的影響，設計三因素三水平響應面試驗；并通過單因素試驗確定綠豆粉碎粒度、浸提溫度最佳參數。準確稱取5 g 綠豆粉（60～80 目），以料液比1∶10，采用最佳浸提緩沖溶液，在20 ℃條件下100 r/min搖床振蕩浸提4 h，測定浸提液凝集活性。固定其他條件，分別對綠豆粉碎粒度（40～120目及120 目以上）、浸提溫度（5～50 ℃）、料液比（1∶4～1∶12）、NaCl濃度（0～0.6 mol/L）及浸提時間（2～10 h）進行考察。

1.3.5 綠豆凝集素浸提響應面優化

在單因素試驗的基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法[18-19]，分別以A、B、C代表料液比、NaCl濃度、浸提時間3個因素，試驗設計見表1。采用Design-Expert設計Box-Behnken試驗。17 個試驗點可分為兩類：一類為析因點，自變量取值在A、B、C所構成的三維頂點，共有12 個析因點；另一類為零點，為區域的中心點，零點試驗重復5 次，用以估計試驗誤差。

表1 響應面試驗因素與水平Table1 Coded levels for independent variables used in response surface analysis (RSA)

1.3.6 綠豆凝集素的鹽析提取

對綠豆凝集素浸提液進行兩次30%～70%的梯度硫酸銨鹽析[20]。第1次鹽析分別收集30%～40%、40%～50%、50%～60%和60%～70%硫酸銨飽和度鹽析沉淀，測定凝集活性，將凝集活性最高的硫酸銨鹽析沉淀混合后，同樣方法進行第2次硫酸銨鹽析。收集凝集活性最高的鹽析沉淀物用于層析純化。

1.3.7 葡聚糖凝膠層析對綠豆凝集素浸提液進行純化

將雙重硫酸銨鹽析后的蛋白質沉淀配成10 mg/mL溶液1 mL，上已經平衡好的Sephadex G-75層析柱，以流速0.7 mL/min生理鹽水進行洗脫，用核酸蛋白檢測儀進行檢測，自動收集器進行接樣，4 min/管[21]。

2 結果與分析

2.1 兔血紅細胞處理方法優化

圖1 戊二醛處理兔血紅細胞對其4 ℃保存穩定性的影響Fig.1 Effect of glutaraldehyde treatment on the stability rabbit red blood cells stored at 4 ℃

從圖1可知，未經戊二醛固定處理的新鮮兔血紅細胞及以體積分數為0.05%～0.10%的戊二醛處理的兔血紅細胞在4 ℃保存時，10 d內均發生溶血，凝集活性失去或降低，說明溶液中的戊二醛的醛基不能與全部兔血紅細胞表面的氨基發生交聯反應使紅細胞得以固定，戊二醛添加量不 足。以0.15%戊二醛處理的在第10天依然沒有凝集活性降低，事實上在第30天依然具有良好的凝集活性，說明0.15%戊二醛能夠使全部的紅細胞得以固定，延長了其保存時間；但當戊二醛達到0.20%時，處理20 min會使兔血紅細胞泥的顏色變黑，并且紅細胞間黏著性增強，不易分 散成細胞懸浮液。這可能是因為戊二醛的兩個醛基與兔血紅細胞蛋白質間是以雙鍵的形式結合，而使細胞組織得以固定的，當大量的戊二醛滲透到細胞組織內部時，破壞了蛋白質的空間結構[4,22]。因此，本實驗采用0.15%戊二醛25 ℃處理新鮮兔血紅細胞20 min。

圖2 胰蛋白酶添加量對兔血紅細胞凝集活性滴度的影響Fig.2 Effect of trypsin treatment on the agglutinating activity of rabbit red blood cells

從圖2可知，不同量胰蛋白酶處理兔血紅細胞，其凝集活性滴度呈先增加后降低趨勢。說明當胰蛋白酶處理時間一定，胰蛋白酶只有達到一定濃度（16 U/mL），才能提高兔血紅細胞的凝集活性滴度；并且具有最佳胰蛋白酶添加量范圍，超過這個范圍（25～28 U/mL），反而使兔血紅細胞的凝集活性滴度下降。分析認為，由于凝集素具有糖結合專一性，胰蛋白酶處理兔血紅細胞，使細胞表面被包埋在膜的脂質雙分子層中的糖蛋白的糖基暴露出來，從而與凝集素特異性結合，而提高了其凝集活性；當胰蛋白酶濃度過大時，紅細胞表面的糖蛋白被過度水解，糖基被剝離紅細胞表面，而使凝集活性降低。綜合分析，采用25 U/mL胰蛋白酶處理戊二醛固定后的兔血紅細胞15 min。

2.2 最佳浸提緩沖溶液的確定

圖3 不同浸提液提取綠豆凝集素的凝集反應現象Fig.3 Coagulation phenomenon of mung bean lectin extracted with different solvents

從圖3可以看出，在相同的浸提條件下，PBS浸提的綠豆凝集素粗提液的凝集活性滴度最大，達到24，能夠最大限度的提取綠豆凝集素。因此本實驗采用PBS作為浸提綠豆凝集素的緩沖溶液。

2.3 不同條件對綠豆凝集素浸提的影響

2.3.1 粉碎粒度對綠豆凝集素浸提 的影響

圖4 粉碎粒度對綠豆凝集素比活力的影響Fig.4 Effect of mung bean granularity on the activity of mung bean lectin

如圖4所示，當粉碎粒度從20～40 目增加到80～100 目時，綠豆凝集素凝集活性不斷增強，從25.0 U/mg增加到109.8 U/mg；粉碎粒度在80～100 目左右時，提取液凝集活性達到最大，因此浸提綠豆凝集素時，將綠豆粉碎至80～100 目。

2.3.2 浸提溫度對綠豆凝集素浸提的影響

圖5 浸提溫度對綠豆凝集素比活力的影響Fig.5 Effects of extraction temperature on the activity of mung bean lectin

從圖5可知，隨著溫度的升高，浸提液中綠豆凝集素活性呈現先增加后降低的趨勢。從實驗的方便性出發，選擇25 ℃提取綠豆凝集素。

2.3.3 浸提時間對綠豆凝集素浸提的影響

圖6 浸提時間對綠豆凝集素比活力的影響Fig.6 Effect of extraction time on the activity of mung bean lectin

由圖6可見，隨著浸提時間的延長，凝集素比活力不斷增加，浸提6 h達到最高值，然后開始下降。

2.3.4 料液比對綠豆凝集素浸提的影響

由圖7可以發現，不同的料液比對浸提液凝集素比活力有顯著影響，當料液比1∶4時，由于浸提液濃度較高使浸提溶液具有較大凝集活性；當料液比不斷降低，浸提溶液凝集活性先升高后降低，在料液比1∶10左右時達到最大。

圖7 料液比對綠豆凝集素比活力的影響Fig.7 Effect of solid-liquid ratios on the activity of mung bean lectin

2.3.5 NaCl濃度對綠豆凝集素浸提的影響

圖8 NaCl濃度對綠豆凝集素比活力的影響Fig.8 Effect of NaCl concentration on the activity of mung bean lectin

由圖8可見，當緩沖溶液中不添加NaCl時，綠豆凝集素比活力很低，隨著NaCl濃度的升高，綠豆凝集素比活力開始升高，并在NaCl濃度0.3 mol/L時到到最大值，然后逐步降低并保持綠豆凝集素比活力的穩定，如圖8所示。

2.4 響應面法優化綠豆凝集素提取工藝條件

2.4.1 模型方程的建立與顯著性檢驗

表2 響應面試驗分析方案及結果Table2 Program and experimental results of RSA

利用Design-Expert軟件，通過表2中葉綠豆凝集素比活力試驗數據進行多元回歸擬合，獲得綠豆凝集素比活力對編碼自變量料液比、NaCl濃度和浸提時間的回歸方程為：Y=134.21＋6.82A－0.31B＋9.73C－0.48AB＋1.77AC＋0.24BC－38.91A2－47.45B2－60.90C2?；貧w方差分析顯著性檢驗（表3）表明，整體模型的P值小于0.01，表明該二次方程模型極顯著，失擬項不顯著，表明模型擬合有效，可以較好地描述各因素與響應值的真實關系。料液比和浸提時間的P值均小于0.01，對綠豆凝集素浸提影響極顯著，而NaCl濃度對綠豆凝集素浸提影響不顯著。由回歸方程的各項方差分析結果表明，一次項和二次項都有顯著性因素，表明選取的3因素對綠豆凝集素比活力的影響不是簡單的線性關系，平方項對響應值也有很大影響。

表3 回歸模型方程的方差分析Table3 Analysis of variance for the regression model

2.4.2 影響綠豆凝集素浸提比活力的主要因素分析

利用Design-Expert軟件對表2的數據進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應面及其等高線見圖9。由圖9a可知，當固定NaCl濃度不變時，隨著料液比的減小，浸提液中綠豆凝集素比活力呈現增加的趨勢；等高曲線較密集，說明料液比對綠豆凝集素浸提影響顯著，這一點從響應曲面陡峭程度上也可以直觀的觀察到，并在編碼值0.089附近達到最大響應值最高點，而后略有下降；當固定浸提時間，由圖9b分析亦可得出相同結論；這與本研究的單因素試驗料液比對綠豆凝集素浸提影響的結果一致。浸提液較少時，浸提液不足以完全將綠豆粉中的凝集素浸出，還會增加其他雜質的浸出濃度；浸提液較多時，增加的浸提緩沖溶液將浸出的凝集素稀釋，從而造成凝集活性的降低，且后期凝集素純化制備時將增加濃縮成本。

當固定料液比、NaCl濃度時，由圖9b、c分析可知，隨著浸提時間的延長，比活力呈現先增加后減小的趨勢，等高曲線在料液比增加（圖9b）時比NaCl濃度增加（圖9c）時更為密集，說明浸提時間、料液比之間的交互作用與浸提時間、NaCl濃度之間的交互作用相比更為明顯，但是二者均不顯著；綠豆凝集素比活力在A編碼值0.089，B編碼值－0.004附近取得最大響應值。與本研究的單因素試驗浸提時間對綠豆凝集素浸提影響的結果一致。這可能是因為隨著浸提時間的延長，綠豆凝集素不斷浸提至溶液中，使比活力增加；但是浸提時間達到一定范圍時，凝集素已經完全浸出到溶液中或達到一種浸出平衡狀態，此時再延長浸提時間，將會使凝集素與空氣接觸時間延長，溶液中微生物的繁殖以及提取過程中的不斷攪拌震動，使綠豆凝集素被氧化或者空間結構被生物、物理因素破壞而降解失活。

固定料液比和浸提時間，分析圖9a、b，可以發現隨著NaCl濃度的增加，綠豆凝集素的比活力呈現先增加后降低的趨勢，從等高曲線分析NaCl濃度、料液比之間的交互作用和浸提時間、料液比之間的交互作用均不顯著，綠豆凝集素比活力在A編碼值0.5，B編碼值0附近達到響應值最高點，這與本研究的單因素試驗NaCl濃度對綠豆凝集素浸提影響的結果一致?？赡苁且驗榫G豆凝集素時鹽溶蛋白，在PBS緩沖溶液中，提高NaCl濃度，會增加綠豆凝集素的溶出，使凝集活性增加；而NaCl濃度繼續提高時，導致綠豆凝集素提取液中蛋白質與其他物質形成不溶性的蛋白復合物。

圖9 各因素間等高線及響應曲面圖Fig.9 Response surface and contour plots showing the effects of extraction conditions on the activity of mung bean lectin

利用Design-Expert軟件對表2的數據進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應面及其等高線見圖9。通過軟件Design-Expert求解方程，可以得出模型的極值點：A =0.089；B=－0.004；C =0.081。經過轉換得出最優提取條件為料液比1∶9.09、NaCl濃度0.3 mol/L、浸提時間4.16 h，最大綠豆凝集素比活力134.91 U/mg。使用優化最佳條件進行驗證實驗，結果表明，凝集素比活力為139.02 U/mg，與預測值很接近，說明模型可以起到一定的預測作用。

2.4.3 硫酸銨雙重鹽析結果

第1次鹽析當硫酸銨飽和度分別為40%、50%、60%和70%時，所獲得的蛋白質沉淀的凝集活性比活力分別為131.66、 340.14、536.37 U/mg和95.37 U/mg，因此收集40%～60%的硫酸銨飽和度范圍鹽析蛋白質沉淀進行第二次硫酸銨分級鹽析。

圖11 硫酸銨分級鹽析結果Fig.11 Ammonium sulfate salting-out of mung bean lectin

從圖11可知，兩次鹽析在硫酸銨飽和度為60%左右得到最高凝集素比活力，第1次鹽析 和第2次鹽析與驗證實驗相比純化倍數分別達到3.86和5.80。

2.4.4 葡聚糖凝膠層析對綠豆凝集素粗提液進行純化

對硫酸銨雙重鹽析后的凝集素粗品采用葡聚糖凝膠G-75進行分子篩層析，用電腦紫外檢測器進行檢測。在20 min和44 min分別出現峰1和峰2，收集樣品進行凝集活性檢驗發現，峰1具有凝集活性，活 性達到1 611.82 U/mg，純化倍數達11.59；峰2不具有凝集活性。

圖12 葡聚糖凝膠層析譜圖Fig.12 Gel filtration chromatography of mung bean lectin on Sephadex G-75 column

3 討論與結論

實驗確定了綠豆凝集素凝集活性檢測最佳兔血紅細胞處理條件，戊二醛體積分數0.15%，25 ℃固定25 min；胰蛋白酶添加量20 U/mL，25 ℃處理15 min；改進后的兔血紅細胞處理方法具有更靈敏的凝集活性反應，并能保持凝集活性30 d以上。

采用響應面法對綠豆凝集素提取方法進行優化，得到擬合方程Y=134.21＋6.82A－0.31B＋9.73C－0.48AB＋1.77AC＋0.24BC－38.91A2－47.45B2－60.90C2，以及提取最優條件為料液比1∶9.09、NaCl濃度0.3 mol/L、浸提時間4.16 h，最大綠豆凝集素比活力139.02 U/mg。

在最優條件下浸提的綠豆凝集素粗品經雙重硫酸銨分級鹽析，在40%～60%飽和度范圍內有最大凝集活性，經過葡聚糖凝膠G-75過濾，得到綠豆凝集素比活力達1 611.82 U/mg，凝集活性提高11.59 倍。

本研究優化了綠豆凝集素浸提方法，采用硫酸銨雙重鹽析之后進行葡聚糖分子篩層析的分離方法，減小了綠豆凝集素純化過程中的活性損失，具有一定的應用前景。

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Response Surface Methodology to Optimize the Extraction Process of Mung Bean Lectin

HUANG Ze-hua1, WANG Qian-wen1, ZHANG He1, LI Yu-nan1, LI Qing-bo1, CAO Long-kui1,2,*
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China; 2. Agri-Food Processing and Engineer ing Technology Research Center of Heilongjiang Province, Daqing 163319, China)

The experiment was designed to use erythrocytes for assaying the agglutinating activity of mung bean lectin, and to improve the processing conditions for glutaraldehyde- and trypsin-treated rabbit red blood cells. Rabbit red blood cells (RBC) were fixed with 0.15% (V/V) glutaraldehyde at 25 ℃ for 20 min, and the RBC were treated with trypsin (25 U/mL) at 25 ℃ for 15 min to increase the assay activity and extend their preservation time. In the investigation, we found that the most suitable extraction solvent for mung bean lectin was phosphate buffer solution. Based on the results of single-factor experiments, a Box-Behnken design (BBD) of three variables at three levels each was carried out to obtain maximum activity of mung bean lectin by response surf ace analysis. The maximum activity of mung bean lectin was predicted to be 134.91 U/mg and observed to be 139.02 U/mg under the optimum extraction conditions: solid-to-liquid ratio, 1:9.09 (g/mL); NaCl concentration, 0.3 mol/L; and extraction time, 4.16 h.

mung bean lectin; response surfac e analysis; optimization; extraction

R284.2

A

1002-6630（2014）20-0031-06

10.7506/spkx1002-6630-201420007

2013-10-31

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD34B0205）

黃澤華（1988—），男，碩士研究生，研究方向為農產品加工。E-mail：huangzehua1988@163.com

*通信作者：曹龍奎（1965—），男，教授，博士，研究方向為農產品加工。E-mail：caolongkui2013@163.com