LTA對BALB/c幼鼠腸黏膜TLR4表達的影響

，(.南華大學附屬第一醫院燒傷整形外科，湖南 衡陽 400；.湖南省環境生物學院生物化學教研室)

LTA對BALB/c幼鼠腸黏膜TLR4表達的影響

周昌寧1，曹海寧2
(1.南華大學附屬第一醫院燒傷整形外科，湖南 衡陽 421001；2.湖南省環境生物學院生物化學教研室)

目的探討脂磷壁酸(LTA)對BALB/c幼鼠腸黏膜Toll樣受體4(TLR4)表達的影響。方法將30只1周齡BALB/c幼鼠隨機分為正常組、溶媒組和LTA組，分別給予NS、DMSO和LTA各0.1 mL一次性灌胃處理，并于處理后第1周、第2周和第4周分別取幼鼠回腸末端、回盲部及結腸組織，HE染色觀察各段組織病理學變化，免疫組化檢測TLR4蛋白表達情況。結果HE染色顯示與正常組相比，溶媒組和LTA組幼鼠腸黏膜組織均有炎性浸潤尤以經LTA處理后第1周的回腸末端最明顯：其黏膜結構完整性受損，黏膜間隙增寬，炎性細胞浸潤，大量細胞氣球樣變性甚至壞死。免疫組化結果表明各組不同組織不同時間段均表達TLR4;LTA組表達量最高，與正常組和溶媒組相比差異均有顯著性(P<0.05)；各組同一組織TLR4表達隨時間延遲表達量增多以第4周最高，與第1周和第2周相比差異有顯著性(P<0.05)；相同組織在不同組別以結腸表達最高并隨時間延長而增加(P<0.05)；第4周LTA組結腸組織表達量最高，差異均有顯著性(P<0.05)。結論LTA能上調腸黏膜TLR4表達并隨著時間延長而增加，其對LTA識別和反應部位可能主要位于結腸。

脂磷壁酸； 腸黏膜； 二甲基亞砜； TLR4

腸道是人體最大的免疫器官[1]，在機體防御和清除外來抗原中起著重要作用。腸道免疫系統的主要組成部分是腸黏膜免疫[2]，現已逐漸發展成一門獨立的學科，其研究領域含蓋先天性免疫和獲得性免疫等方面。腸道細菌總數達1014以上，遠遠超過體細胞數量1013，這些腸道細菌通過表達病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)來被先天性免疫系統中的模式識別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)所識別[3]。新生兒腸道是無菌的，腸黏膜免疫系統尚未發育，隨著腸道菌群的定植，腸道黏膜免疫系統逐步發育完善，因而腸道菌群被認為是腸黏膜免疫系統發育和成熟的始動因素。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是先天性免疫系統中的一類重要的PRRs，TLRs通過與PAMP結合啟動腸黏膜免疫[4]，激活細胞內信號轉導通路，分泌各種趨化因子和細胞因子來發揮抗感染免疫作用，因而被認為是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。在腸黏膜免疫中一般認為TLRs家族中TLR4與共生菌定植、抵抗病原微生物入侵以及腸道共生菌的耐受相關。目前對腸黏膜免疫的研究主要集中于革蘭氏陰性細菌及其細胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)[5]，而對革蘭氏陽性細菌及其細胞壁成分LTA在黏膜免疫中的作用報道較少。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

葡萄球菌脂磷壁酸(LTA 5 mg/支) 購自Sigma公司，用DMSO配成0.1 mg/mL溶液。DMSO 由南華大學免疫與微生物教研室惠贈。免疫組化相關試劑：TLR4單克隆抗體鼠購自 Abgent公司，SP免疫組化試劑盒DBA顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

將30只1周齡BALB/c幼鼠隨機分為三組：正常組、溶媒組和LTA組，每組10只，分別給予NS(陰性對照)、DMSO(溶媒對照)和LTA 0.1 mL一次性灌胃處理并于處理后第1周、第2周、第4周取出幼鼠回腸末端、回盲部、結腸，HE染色觀察各段組織病理學變化，免疫組化檢測TLR4蛋白表達情況。在每張免疫組化切片中隨機選取5個不連續的視野(×200)，采用Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件進行圖像分析，分析同時相點各個視野TLR4陽性細胞表達的積分光密度值(integral optical density,IOD)。

1.3 統計分析

2 結 果

2.1 回腸末端黏膜組織學變化

正常組BALB/c幼鼠回腸末端可見絨毛結構且絨毛細而短，可見杯狀細胞、柱狀細胞；回盲部可見淋巴濾泡、淋巴小結及彌散淋巴組織；結腸內未見絨毛但在固有層內可見散在的結腸腺。溶媒組BALB/c幼鼠回腸末端腸黏膜較完整，且腸黏膜稍水腫，細胞間隙略增寬甚至可見少量炎性細胞浸潤，第1周改變最明顯，第2周后炎性反應消失；回盲部可見淋巴濾泡反應性增生，結腸固有層內可見散在的結腸腺。LTA組BALB/c幼鼠回腸末端黏膜結構完整性破壞，黏膜面可見大量細胞呈氣球樣變性甚至發生壞死，細胞間隙明顯增寬，尤以LTA處理后的第1周改變最顯著(圖1)；回盲部可見大量淋巴結和淋巴濾泡反應性增生；結腸固有層反應性增生，腸腺偶見變性水腫及炎性細胞浸潤。第2周后炎性反應開始逐漸消失。

2.2 TLR4免疫組化及圖象分析

三組各個部位腸黏膜不同時間段均表達TLR4，見圖2。各組TLR4陽性細胞積分光密度值(integral optical density,IOD)：LTA組表達量最高，與正常組和溶媒組相比差異均有顯著性(P<0.05)；各組同一組織TLR4表達隨時間延遲表達量逐漸增多以第4周最高，與第1周和第2周相比差異均有顯著性(P<0.05)；相同組織在不同組別以結腸表達最高并隨時間延長而增加，差異均有顯著性(P<0.05)；第4周LTA組結腸組織表達量最高(P<0.05，表1)。

3 討 論

自上個世紀的50年代后期Burnet提出克隆選擇學說以來對獲得性免疫系統的研究取得了突飛猛進的進展，甚至曾一度獨占免疫學舞臺。直至90年代后期多種天然免疫識別分子的結構、功能及分子機制被發現導致了天然免疫的迅速崛起。Nature2001年第410卷有文獻報道：天然免疫這個“灰姑娘”將在21世紀登上免疫學舞臺的中心。腸道不僅是消化器官而且是最大的免疫器官,腸道細菌總數達1014，種類超過了1 000種[6-7]。如何保持這些細菌正常地發揮功能非常重要,尤其對于嬰幼兒處于免疫系統發育的關鍵時期，可以影響到嬰幼兒生長發育甚至是遠期健康狀況。嬰幼兒腸道共生菌群含大量需氧菌，這些需氧菌在革蘭氏陰性細菌以大腸桿菌為代表，在革蘭氏陽性細菌以金黃色葡萄球菌為代表，它們在體內代謝可以釋放其細胞壁成分LPS 、LTA等，能持續作用于腸黏膜。TLRs是先天性免疫系統中的一類重要的PRRs，目前至少已報道了13種TLR[8]，在腸黏膜免疫方面普遍認為TLR4與腸道共生菌定植、抵抗病原微生物入侵以及腸道共生菌的耐受密切相關。在靜息狀態下TLR4表達于細胞表面就可以更好的識別細菌細胞壁上的抗原性成分LPS 、LTA 。TLR4在識別這些細菌的PAMP后被活化并誘導相關基因的表達[9]。哺乳動物腸道共生菌的定植是出生后逐步建立形成的，嬰幼兒時期腸道菌群的密度及種類在不同個體或同一個體的不同部位是有差異的，但相對于個體而言其腸道細菌在一定時期內同一部位相對衡定[10]?？梢娞接懗錾蠼浳改c道荷載LTA對腸道不同部位TLR4表達變化對深入了解腸黏膜免疫作用機制有著重要的意義。

表1BALB/c幼鼠各組腸道各段在不同時間點TLR4的IOD表達情況(n=5)

與LTA組同時間比較，a：P<0.05；與同一組織第4周表達比較，b：P<0.05；與LTA組第4周結腸比較，c：P<0.05；與同組結腸表達比較， d：P<0.05

本實驗經胃腸道荷載LTA于BALB/c幼鼠，觀察腸組織各段改變為研究腸黏膜免疫提供實驗依據，通過免疫組化觀察TLR4表達的變化了解TLR4在腸黏膜免疫中的作用提供一定的理論依據。從實驗結果來看無論是通過NS、DMSO 還是LTA處理，TLR4在BALB/c幼鼠回腸末端、回盲部到結腸都是有表達的。從表達部位來看：回腸末端表達最低，回盲部次之而結腸表達最高；從處理因素來看：正常組表達最低，溶媒組次之，LTA組最高，說明LTA在實驗計量條件下可以刺激腸道發生炎癥反應但隨著腸道黏膜免疫發育成熟炎癥反應逐漸減弱甚至消失。DMSO也具有一定的消化道毒性，可以誘導先天免疫應答；從表達時間來看：第4周表達最高，第1周表達最低，可能與此期小鼠腸黏膜免疫系統已發育成熟有關。雖然DMSO具有一定的消化道毒性可以誘導先天免疫應答，但LTA更能明顯上調TLR4的表達，且表達強度明顯高于DMSO，表達水平與LTA 作用時間相關，說明LTA能明顯增強TLR4表達，且其表達水平與LTA作用時間有密切相關?？傊?，TLR4在BALB/c幼鼠回腸末端、回盲部到結腸都有基礎性的表達，經胃腸道荷載實驗計量條件下，DMSO、 LTA可以誘發腸道炎癥反應尤以LTA明顯，且結腸部位TLR4表達明顯高于回腸末端和回盲部，提示腸道對LTA識別和反應的部位主要發生于結腸。

[1] Swiatczak B,Rescigno M.How the interplay between antigen presenting cells and microbiota tunes host immune responses in the gut[J].Semin immunol，2012,24(1):43-49.

[2] 徐凱進，李蘭娟.腸道正常菌群與腸道免疫[J].國外醫學(流行病學：傳染病學分冊)，2005,32(3):181-183.

[3] 王莉莉，王虹艷，曲鵬.模式識別受體在動脈粥樣硬化中的作用及相互關系[J].中國動脈硬化雜志，2012，20(10)：951-955.

[4] Wells JM.Immunonodulatory mechanisms of lactobacilli[J].Micro cell Fact，2011，(10 suppl 1)：S17.

[5] Vamadevan AS，Fukata M，Arnold ET，et al.Regulation of Toll-like receptor 4-associated MD-2 in intestinal epithelial cells:a comprehensive analysis[J].Innate Immun，2010，1(2)：93-103.

[6] Gill SR,Pop M,Deboy RT,et al.Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome[J].Science，2006,312(5778):1355-1359.

[7] Qin J，Li R，Rase J，et al.A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J].Nature，2010,464(7285)：59-65.

[8] Hana M，Hana VM.Toll-like receptor and theirdual role in periodontitis:a review[J].Oral Sci，2011，53(3)：263-271.

[9] Guo J，Friedman SL.Toll-like receptor 4 signaling in liver injury and hepatic fibrogenesis[J].Fibrogenesis Tissue Repair，2010,3(21):1-19.

[10] Palmer C,Bik EM,DiGiulio DB,et al.Development of the human infant intestinal microbiota[J].PLoS biol，2007,5(7):e 177.

ChangesofExpressionofTLR4InducedbyLTAinIntestinalMucosaofBALB/cMicePups

ZHOU Changning，CAO Haining
(DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina，Hengyang，Hunan421001,China)

ObjectiveTo observe the expression of TLR4 in intestinal mucosa of BALB/c mice pups.Method30 BALB/c mice postnatal one week were randomly divided into normal group,solvent group and LTA group,and were administrated with NS,DMSO or LTA 0.1ml one time,respectively.The pups intestine were taken out at the first,second and fourth week and the terminal ileum,cecum and colon were separated.The pathological change of the tissues were analyzed by HE staining and the expression of the TLR4 were detected by immunohistochemistry (IHC).ResultHistological examination showed that inflammatory infiltration was observed in solvent control group and LTA group.The integrity of mucosal structure was injured,the gap of the mucosa was widened and inflammatory cell infiltration or ballooning degeneration even necrosis was observed,especially in the terminal ileum of the LTA group at first week.The results of the immunohistochemistry indicated that the expression of TLR4 were detected in different tissues at different time period in three groups; the expression level of TLR4 in LTA group was the highest,compared with normal group and solvent group (P<0.05); The expression of TLR4 in the same tissues of different groups were increased over time and the level of TLR4 at the fourth week were higher when compared with which at the first or second week(P<0.05); the expression of TLR4 in colon were the highest and increased over time and the level of TLR4 in colon at the 4th week was the highest(P<0.05).ConclusionLTA can up-regulate the expression of TLR4 in the intestinal mucosa,and the site of the LTA recognition and reaction may be mainly located in the colon.

Lipoteichoic acid； intestinal mucosa； Dimethyl sulfoxide； TLR4

2095-1116(2014)05-0455-04

2014-05-30

周昌寧，博士，主治醫師，研究方向：燒燙傷所致腸源性感染，E-mail:zcn8888@sina.com.

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(此文編輯：蔣湘蓮)