組蛋白乙?；揎椪{控RAR-β2表達與宮頸病變的相關性*

伍嬌嬌 馮定慶 田 園 徐漢杰 李 兵 凌 斌

組蛋白乙?；揎椪{控RAR-β2表達與宮頸病變的相關性*

伍嬌嬌 馮定慶 田 園 徐漢杰 李 兵 凌 斌

目的：探討組蛋白乙?；揎椗cRAR-β2表達及宮頸病變發生發展的關系。方法：收集正常宮頸、宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅱ～Ⅲ和宮頸鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）組織，分別采用免疫組織化學和Western Blot方法檢測AcH3、RAR-β2和Involucrin的表達；分析組蛋白乙?；脚cRAR-β2表達及宮頸病變程度的關系。結果：隨著宮頸病變的進展，AcH3、RAR-β2和Involucrin的表達逐漸降低，甚至缺失，組間差異有統計學意義（P＜0.05）；組蛋白乙?；脚cRAR-β2表達呈正相關（r=0.797，P＜0.05），AcH3和RAR-β2的表達均與宮頸病變程度呈負相關［r=-0.547（AcH3），r=-0.585（RAR-β2），P＜0.05］。結論：組蛋白乙?；揎椗cRAR-β2表達調控有關，并可能參與宮頸癌的發生。

組蛋白乙?；揎?RAR-β2宮頸上皮內瘤變 宮頸鱗狀細胞癌 分化

Department of Obstetrics and Gynecology,Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University,Anhui Provincial

Key Laboratory of Molecular Medicine,Hefei 230001,China.

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(Grant Nos.81072127 and 30901606),Anhui Pro

vincial Natural Science Foundation(Grant No.11040606M176),and Scientific Research Foundation of Universities and Colleg

es,Anhui Medical University(No.2012XKJ046).

宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤之一，其病因與高危型HPV感染宮頸上皮基底細胞，導致上皮分化成熟障礙，繼而惡性轉化；病變經歷了宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級到宮頸癌的漸進過程，但具體機制仍不明確。RAR-β2是一種重要的腫瘤抑制基因，在上皮細胞分化過程中發揮重要的調控作用，其表達降低/缺失與多種腫瘤的發生密切相關［1-2］。最新的研究證實，組蛋白乙?；揎椡ㄟ^表觀遺傳途徑調控多種與細胞周期、分化、凋亡相關基因的表達，通過與RAR-β2基因啟動子區RARE直接作用，調控RAR-β2的表達，與腫瘤發生密切相關［3-4］。本研究擬檢測不同宮頸病變組織中組蛋白乙?；郊癛AR-β2的表達情況，分析兩者之間的相關性，從而探討其與宮頸癌發生發展的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例與組織標本來源 收集安徽醫科大學附屬省立醫院2011年1月至2012年9月間CINⅡ～Ⅲ和宮頸鱗狀細胞癌（cervical squamous cell carcinoma，SCC）石蠟包埋標本56例。其中CINⅡ～Ⅲ26例，SCC 30例；依據FIGO（2009年）宮頸癌臨床分期，Ⅰ期22例（Ⅰa期10例，Ⅰb期12例），Ⅱ期8例（全部為Ⅱa期）；選擇因子宮肌瘤行子宮全切的正常宮頸組織10例作對照。

收集2012年5～11月間手術切除的新鮮宮頸病變組織16例，其中，CINⅡ～Ⅲ8例（陰道鏡活檢下病理確診為CINⅡ～Ⅲ的宮頸病變部位，在LEEP術前用活檢鉗取上述部位），SCC 8例，Ⅰ期5例（Ⅰa期2例，Ⅰb期3例），Ⅱ期3例（全部為Ⅱa期），收集因子宮肌瘤行子宮全切的正常宮頸組織6例作對照。所有標本均保存于-80°C冰箱中待用。

以上全部病例手術前均未行放化療、免疫治療及其它特殊治療，病例資料完整。

1.1.2 試劑 AcH3單克隆抗體、RAR-β2多克隆抗體、Involucrin單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體均購于美國Santa Cruz公司。免疫組織化學染色SP試劑盒、抗原修復液、DAB顯色劑及Western Blot用辣根過氧化物酶標記IgG的山羊抗兔、抗小鼠二抗均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色（SP法） 石蠟切片脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，滴加一抗4°過夜（AcH3、RAR-β2、Involucrin抗體稀釋度分別是1∶50、1∶50、1∶100），滴加聚合物輔助劑室溫20 min，滴加辣根酶標記的相應二抗室溫20 min，DAB染色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性標本作陽性對照。

結果判定標準：以細胞質或細胞核出現黃色或棕黃色顆粒為AcH3、RAR-β2表達陽性細胞，以細胞膜/質出現黃色或棕黃色為Involucrin表達陽性細胞。每張切片按著色強度分為，0分：無染色，1分：弱表達，2分：中表達，3分：高表達；每張切片選擇5個不同視野（×200），按著色細胞百分比，取5個視野的平均值即為每張切片的陽性細胞率，0分：陰性，1分：＜10%，2分：11%～50%，3分：51%～80%，4分：＞80%。以強度和面積得分的乘積評價表達情況［5］，范圍0～12分，0分：陰性（-），1～4分：低表達，＞4分：高表達。

1.2.2 Western Blot 在冰上剪碎CINⅡ～Ⅲ和SCC組織、提取總蛋白并定量，以40 μg蛋白上樣，經SDS-PAGE凝膠電泳分離、電轉、5%脫脂奶粉封閉（TBS-T稀釋）、一抗孵育4℃過夜（AcH3、RAR-β2、Involucrin、GAPDH稀釋度分別是1∶100、1∶100、1∶500、1∶2 000）、對應二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h、化學發光法顯影。運用Alpha Innotech成像系統采集圖像，對條帶光度掃描，檢測各目的蛋白與其對應內參的OD值，以各OD目的蛋白/OD內參比值，取平均值統計分析。

1.3 統計學方法

應用SPSS 13.0軟件行χ2檢驗和t檢驗，相關性分析采用Spearman分析；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學檢測

AcH3、RAR-β2、Involucrin在正常宮頸、CINⅡ～Ⅲ和SCC組織中的表達（圖1）。AcH3、RAR-β2主要定位于細胞質或細胞核，Involucrin主要定位于細胞膜/質。AcH3、RAR-β2、Involucrin在正常宮頸組織的陽性表達率分別是100%、90%、100%（10/10、9/10、10/10），顯著高于CINⅡ～Ⅲ組織84%、76%、88%（22/26、20/26、23/26）及SCC組織46%、46%、33%（14/30、14/30、10/30）；在宮頸病變過程中，AcH3、RAR-β2、Involucrin表達逐漸降低，甚至缺失，三者的表達在各組間差異均有統計學意義（P＜0.05，表1）。

2.2 組蛋白乙?；脚cRAR-β2表達的相關性

Spearman相關性分析結果顯示，組蛋白乙?；脚cRAR-β2的表達呈正相關（r=0.797，P＜0.05，圖2），即隨著宮頸病變的進展，兩者表達同步降低。這與文獻報道一致［3］，在宮頸病變上皮細胞中RAR-β2的表達受組蛋白乙?；降恼{控。

2.3 AcH3、RAR-β2與宮頸病變程度的相關性

在正常宮頸、CINⅡ～Ⅲ、SCC組織中AcH3和RAR-β2的表達均依次降低，即宮頸病變越重，兩者的表達越低，與病變程度呈負相關［r=-0.547（AcH3），r=-0.585（RAR-β）2，P＜0.05，圖3］。

2.4 Western Blot檢測

AcH3、RAR-β2、Involucrin在正常宮頸、CINⅡ～Ⅲ和SCC組織中的表達見圖4。結果顯示，AcH3、RAR-β2、Involucrin的表達與免疫組化結果一致，在正常宮頸、CINⅡ～Ⅲ、SCC組織中逐漸降低。

3 討論

基因的表達除了決定于DNA序列所傳遞的遺傳學信息外，還決定于DNA序列以外的表觀遺傳學信息。隨著對腫瘤認識的深入，利用表觀遺傳學機制揭示腫瘤的發生發展受到眾多學者的關注，并認為是腫瘤病理生理過程中最重要的分子事件之一。組蛋白乙?；揎椩诒碛^遺傳學理論中占有重要地位，通過影響細胞內染色質結構，參與特定位點的基因轉錄調控，在細胞生長、分化過程中發揮關鍵作用；組蛋白富含賴氨酸、精氨酸、組氨酸等帶正電荷的堿性氨基酸，所謂的組蛋白乙?；揎検侵附M蛋白八聚體向外延伸的堿性氨基酸殘基乙?；?，通過增大DNA與組蛋白間的靜電引力和空間位組，兩者間相互作用減弱，選擇性的使某些染色質區域的結構從緊密變得松散，DNA易于解聚，染色質呈轉錄活性結構，有利于轉錄因子與DNA模板相結合，繼而開放某些基因轉錄，增強其表達水平；相反，組蛋白去乙?；?，即乙?；浇档?，使帶正電荷的組蛋白與帶負電荷的DNA緊密結合，染色質呈卷曲致密的抑阻結構，從而抑制基因轉錄，導致調控細胞周期、分化、凋亡的基因轉錄失調。正常細胞內組蛋白乙?；腿ヒ阴；幱谄胶?，動態控制靶基因的穩定表達，調控細胞在適當的時間和空間位置上表達適當的基因，維持細胞正常的生理功能和表型，控制細胞的增殖分化；當乙?；腿ヒ阴；Ш?，組蛋白乙?；浇档蜁r，將引起相應染色質結構和基因轉錄改變，影響細胞周期、分化、增殖、凋亡相關基因的表達，而導致腫瘤的發生和進展。在腫瘤細胞中組蛋白大多數呈去乙?；癄顟B［6-9］，隨著乙?；降慕档?，組織的異質性程度也逐漸增加［10］；本實驗顯示，從正常宮頸、CIN、SCC組織中組蛋白乙?；街饾u降低，甚至缺失，與不同病變卵巢組織的研究結果相似［10］，組蛋白乙?；脚c宮頸病變程度呈負相關，說明表觀遺傳修飾參與宮頸癌的發生發展。

維甲酸（retinoic acid，RA）又稱視黃醇或維生素A酸，是維生素A的衍生物，機體內一定濃度的維甲酸可調節細胞的分化、增殖、成熟，是正常生長發育和各種生理活動必不可少的因子之一。RA是通過與細胞核內維甲酸受體（retinoic acid receptor，RAR）結合而調節細胞的增殖、分化和成熟，發揮廣泛的生物學效應。RAR-β2是RAR-β家族中最重要的成員，也是RA可誘導的主要亞型，與RA結合調控細胞生長，促進細胞分化等而產生抗腫瘤活性，因此，RAR-β2在多種腫瘤中認為是一個腫瘤抑制基因。RAR-β2不但在癌組織中表達減少或缺失，而且在癌前病變組織中的表達同樣是減少或缺失［11-12］，這說明RAR-β2與腫瘤的發生緊密相關。利用轉染RAR-β2的腫瘤細胞株發現，通過誘導腫瘤細胞分化而增加凋亡［13］，其缺失與腫瘤組織的分化程度有關［14］。Involucrin作為上皮細胞終末分化的標記蛋白，是分化成熟的上皮細胞應具備的功能蛋白，Involucrin的表達說明該細胞逐漸向正常分化成熟的方向發展或為分化成熟的上皮細胞，其表達水平與腫瘤細胞的分化程度密切相關，高分化的腫瘤細胞中較中低分化的腫瘤細胞中的表達顯著增多，是判斷腫瘤細胞分化程度的重要標記之一。本研究結果顯示，在正常宮頸、CIN、SCC組織中RAR-β2與Involucrin表達水平均依次降低，各組間的表達水平有顯著差異性，表明正常宮頸組織在轉變為CIN的過程中，上皮細胞中RAR-β2與Involucrin同步發生了變化，使分化成熟的上皮細胞逐漸減少，甚至缺失，增加組織的異質性，導致宮頸癌的發生。

組蛋白作為染色質基本結構核小體的重要組成部分，翻譯后乙?；揎椧鹑旧|結構重塑在細胞周期、分化、凋亡的基因轉錄調控中發揮關鍵作用［6］。有研究表明，RAR-β2基因啟動子沉默與組蛋白乙?；揎椨嘘P，并參與腫瘤的發生［3-4］，即組蛋白乙?；胶鈩討B調控細胞生長分化，組蛋白乙?；癄顟B減少，使細胞去分化、過度增殖，導致腫瘤發生。本課題組前期宮頸癌SiHa、HeLa細胞和裸鼠成瘤實驗結果顯示，組蛋白去乙?；敢种苿┞摵螦TRA（RA化合物）通過顯著上調組蛋白乙?；蕉貑m頸癌細胞RAR-β2的表達，促進上皮細胞終末分化標記Involucrin表達的上調，使腫瘤細胞停滯在G1期，抑制腫瘤細胞生長，從而縮小腫瘤體積，發揮協同抗宮頸癌作用［15］；結合本次利用臨床組織研究顯示，隨著宮頸病變的進展，組蛋白乙?；潭仍降?，RAR-β2的表達也越低，兩者的表達呈正相關，同時，AcH3和RAR-β2均與宮頸病變程度呈負相關；表明組蛋白乙?；揎梾⑴c調控RAR-β2的表達，其乙?；皆降?，導致RAR-β2表達減少，甚至缺失，使宮頸上皮基底細胞分化成熟障礙、出現惡性轉化和細胞周期異常，從而參與宮頸癌的發生發展過程。

1 Ralhan R,Chakravarti N,Kaur J,et al.Clinical significance of altered expression of retinoid receptors in oral precancerous and cancerous lesions：Relationship with cell cycle regulators[J].Int J Cancer,2006,118(5)：1077-1089.

2 Huang H,Wang LF,Tian HM,et al.Expression of retinoic acid receptor-β mRNA and p16,p53,Ki67 proteins in esophageal carcinoma and its precursor lesions[J].Chin J Oncol,2005,27(3)：152-155.［黃 泓,王力峰,田海梅,等.維甲酸受體-β等腫瘤分子標志物在食管正常及異常組織中的表達及意義[J].中華腫瘤雜志,2005,27(3)：152-155.］

3 Zhang Z,Joh K,Yatsuki H,et al.Retinoic acid receptor beta2 is epigenetically silenced either by DNA methylation or repressive histone modifications at the promoter in cervical cancer cells[J].Cancer Lett,2007,247(2)：318-327.

4 Feng DQ,Wu J,Tian Y,et al.Targeting of histone deacetylases to reactivate tumour suppressor genes and its therapeutic potential in a human cervical cancer xenograft model[J].PLoS ONE,2013,8 (11)：e80657.

5 Cheng Y,Zhou Y,Jiang W,et al.Significance of E-cadherin, β-catenin,and vimentin expression as postoperative prognosis indicators in cervical squamous cell carcinoma[J].Human Pathol,2012, 43(8)：1213-1220.

6 Mahlknecht U,Hoelzer D.Histoneacetylation modifiers in the pathogenesis of malignant disease[J].Mol Med,2000,6(8)：623-644.

7 Berqada L,Sorolla A,Yeramian A,et al.Combination of Vorinostat and caspase-8 inhibition exhibits high anti-tumoral activity on endometrial cancer cells[J].Mol Oncol,2013,7(4)：763-775.

8 Mateen S,Raina K,Jain AK,et al.Epigenetic modifications and p21-cyclin B1 nexus in anticancer effect of histone deacetylase inhibitors in combination with silibinin on non-small cell lung cancer cells[J].Epigenetics,2012,7(10)：1161-1172.

9 Meng F,Sun G,Zhong M,et al.Inhibition of DNA methyltransferases,histone deacetylases and lysine-specific demethylase-1 suppresses the tumorigenicity of the ovarian cancer ascites cell line SKOV3[J].Int J Oncol,2013,43(2)：495-502.

10 JiaY,Zou YG,Chen J,et al.Expression of Histone Deacetylase 1 in human epithelial ovarian cancer[J].Chin J Lab Diagn,2011,15(2)：256-258.［賈 研,鄒穎剛,陳 軍,等.組蛋白去乙?；?在上皮性卵巢癌組織中的表達[J].中國實驗診斷學,2011,15(2)：256-258.］

11 Tang M,Wu Q,Wu ZS,et al.Differential expression of COX-2 and RAR-β2and their association in esophageal cancer tissue specimens[J]. Acta Univ Medi Anhui,2012,47(4)：450-453.［唐 曼,吳 強,吳正升,等.COX-2、RAR-β2在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及相互關系[J].安徽醫科大學學報,2012,47(4)：450-453.］

12 Zhong JH,Wang Y,Wang XC,et al.Expression and significance of retinoic acid receptor-β in cervical cancer[J].China of Care Health Child Maternal,2013,28(18)：2991-2994.［衷敬華,王 勇,王祥財,等.維甲酸受體β在宮頸癌中的表達及其意義[J].中國婦幼保健,2013,28(18)：2991-2994.］

13 Toulouse A,Loubeau M,Morin J,et al.RARbeta involvement in enhancement of lung tumor cell immunogenicity revealed by array analysis[J].FASEB J,2000,14(9)：1224-1232.

14 Xie F,Xiang XY,Zhang JC,et al.Methylation of retinoic acid receptor β2 promoter in sporadic breast cancer tissue[J].Canc Res on Prev Trea,2011,38(4)：408-415.［謝 飛,向希映,張吉才,等. RAR-β2基因啟動子異常甲基化與散發性乳腺癌的關系[J].腫瘤防治研究,2011,38(4)：408-415.］

15 Feng D,Cao Z,Li C,et al.Combination of Valproic Acid and ATRA Restores RAR2 Expression and Induces Differentiation in Cervical Cancer through the PI3K/Akt Pathway[J].Curr Mol Med, 2012,12(3)：342-354.

（2013-07-15收稿）

（2013-10-24修回）

（本文編輯：賈樹明）

Correlation between cervical lesion development and histone acetylation modification that regulates RAR-β2expression

Jiaojiao WU,Dingqing FENG,Yuan TIAN,Hanjie XU,Bing LI,Bin LING
Correspondence to:Bin LING;E-mail:lingbin.ling@gmail.com

Objective:To investigate the relationship between cervical lesion development and histone acetylation that regulates RAR-β2expression.Methods:Immunohistochemistry and Western blot analysis were performed to detect AcH3,RAR-β2,and involucrin expression in normal cervical tissues as well as in tissues with cervical intraepithelial neoplasia(CIN)Ⅱ-Ⅲand squamous cell cervical carcinoma.The relationship among histone acetylation level,RAR-β2expression,and cervical lesion severity were analyzed.Results:AcH3,RAR-β2,and involucrin expression were reduced or absent with the progression of cervical lesions;significant differences were noted between the groups(P＜0.05).Histone acetylation level and RAR-β2expression were positively correlated(r=0.797,P＜0.05).AcH3 and RAR-β2expression,which were both associated with the cervical lesions,were negatively correlated[r=-0.547(AcH3), r=-0.585(RAR-β2),P＜0.05].Conclusion:Histone acetylation modification is associated with the regulation of RAR-β2expression.This process is also likely to participate in the carcinogenesis of cervical carcinoma.

histone acetylation modification,RAR-β2,cervical intraepithelial neoplasia,squamous cell cervical carcinoma,differentiation

10.3969/j.issn.1000-8179.20131140

伍嬌嬌 碩士，主治醫師。研究方向為婦科腫瘤臨床與基礎研究。

安徽醫科大學附屬省立醫院婦產科，安徽省分子醫學重點實驗室（合肥市230001）

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81072127，30901606）、安徽省自然科學基金項目（編號：11040606M176）和安徽醫科大學高?？蒲谢痦椖浚ň幪枺?012XKJ046）資助

凌斌 lingbin.ling@gmail.com

E-mail：wubaiwanzjs@163.com