Notch信號通路在乳腺癌干細胞中的研究進展*

郭 瑢 綜述 張 瑾 審校

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Notch信號通路在乳腺癌干細胞中的研究進展*

郭 瑢 綜述 張 瑾 審校

乳腺癌干細胞是一群具有自我更新及多向分化潛能的細胞，在乳腺癌的發生、發展以及轉移、復發中起著極其重要的作用。正常情況下，乳腺干細胞的分化、更新能力受相關信號轉導通路的嚴格調控，當這些信號通路發生異常干細胞將會異常分化，形成乳腺癌干細胞，并無限增殖形成腫瘤。隨著人們對乳腺癌干細胞的深入研究，Notch信號通路與其他信號通路的相互作用對乳腺癌干細胞的調控逐漸被人們所重視。本文為進一步了解Notch信號通路在乳腺癌的發生、發展以及靶向治療中的重要意義，結合乳腺癌干細胞信號通路的最新研究進展進行綜述。

Notch 信號通路 乳腺癌 乳腺癌干細胞 靶向治療

Notch基因最早于1917年由Tomas Hunt Morgan在果蠅中發現，因其功能部分缺失使果蠅翅膀的邊緣造成切跡而命名。Notch信號通路是一條影響細胞命運的重要通路，Notch受體通過與鄰近細胞表達的配體直接接觸而被激活，調控細胞的增殖、分化和凋亡［1］。Notch信號異常在乳腺癌的發生、發展中起到了重要作用，對乳腺癌干細胞的調控受到廣泛的關注［2］。另外，Notch信號通路與其他信號通路間存在密切的相互作用，針對Notch信號通路的靶向藥物將給乳腺癌的治療帶來新的方向［3］。本文旨在回顧近年來Notch信號通路的相關研究，探索Notch信號通路以及其相關因子對乳腺癌干細胞的影響，揭示其與腫瘤形成的關系，為基于Notch信號通路治療乳腺癌提供理論依據。

1 Notch信號通路的組成及其活化

1.1 Notch信號通路的組成

Notch信號通路由Notch受體、Notch配體及細胞內效應器分子CSL DNA結合蛋白3部分組成。Notch受體屬于單次跨膜蛋白家族，在哺乳動物中共發現4類Notch基因，編碼4種Notch受體，分別為Notch 1～4。由Notch胞外區（Notch extracellular domain，NEC）、Notch跨膜區（Notch trans-membrane domain，NTM）和Notch胞內區（Notch intracellular domain，NICD）3個部分組成。Notch配體，即Delta/Serrate/LAG2（DSL）家族，又被稱為DSL蛋白。至目前在哺乳動物中發現5種配體：Delta-like1、3和4（DLL1、DLL3、DLL4）以及Jagged1、Jagged 2。細胞內效應器分子，即CSL DNA結合蛋白，是CBF-1/Suppresor of Hairless/LAG1的合稱，在哺乳動物中稱為RBP-Jκ（recombination signal binding protein-Jκ），為Notch信號通路中起關鍵作用的轉錄調節因子。

1.2 Notch信號通路的活化

CBF-1/RBP-Jκ依賴途徑是經典的Notch信號通路。Notch信號轉導在活化過程中經3次裂解：Notch受體在內質網中合成無活性的單肽，在高爾基體內的furin樣轉化酶作用下，在裂解點S1發生第1次裂解，形成活化的異二聚體形式的Notch受體，包括胞外區和跨膜片段2個亞基。受體與配體結合后，在解聚素和金屬蛋白酶/腫瘤壞死因子-α轉換酶作用下發生第2次裂解（裂解點S2），N端裂解產物（胞外區）被配體表達細胞吞噬，而C端裂解產物進一步在跨膜區的第3個裂解點S3，經γ-分泌酶復合體裂解，釋放Notch受體的活化形式NICD［1-3］。NICD進入細胞核，結合CSL蛋白并募集核轉錄激活蛋白家族MAML（mastermind-like family members），形成三元絡合轉錄激活物（NICD-CSL-MAML），從而激活靶基因的轉錄。Notch靶基因轉錄編碼包括Hes與Hey在內的堿性螺旋-環-螺旋（basic-helix-loop-helix）家族轉錄因子，這些轉錄因子促進下游基因的表達，從而促進細胞增殖、抑制細胞分化［2］。

1.3 乳腺癌干細胞中Notch的活化

乳腺癌干細胞中Notch信號通路的活性成為乳腺癌干細胞最近的研究熱點。乳腺癌干細胞中Notch的表達可以啟動具有CD44+/CD24-表面標志的細胞群，這與腫瘤的發生以及高侵襲性密切相關，而Notch受體抑制劑可以降低乳腺癌干細胞微球體形成率。

Notch1與乳腺癌干細胞的自我更新有關。Notch1胞內區的激活能夠促進乳腺癌干細胞的自我更新，沉默Notch1相反將導致乳腺癌干細胞及乳腺癌細胞生長停滯并促進其凋亡。最近的研究再次證實，沉默Notch1后乳腺癌干細胞微球體的形成減少，細胞的運動侵襲能力下降，小鼠體內腫瘤形成能力下降，表明Notch1與乳腺癌干細胞的惡性行為密切相關［4］。Notch1主要在正常乳腺表面導管上皮（Luminal）A細胞中表達，而Notch4主要存在于乳腺基底導管上皮（Basal-like）B細胞中以及乳腺癌干細胞（breast cancer stem cells，BCSC）富集的群體中，表明Notch1及Notch4通過影響BCSC中不同亞群的細胞產生不同作用，抑制Notch1活性，僅在一定程度上減少了乳腺微球體形成單位（mammosphere forming units，MFUs）并抑制腫瘤的形成，而Notch4基因的敲降引起MFUs的顯著抑制［5］。

Notch2與Notch3也與BCSC有關。最近的研究發現，位于1p11.2區域的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）rs11249433為ER陽性乳腺癌新的危險因子，而Notch2表達在攜帶有危險基因型（AG/GG）的rs11249433中明顯增高，Notch2在ER陽性Luminal型乳腺癌干細胞的分化中起關鍵作用，攜帶rs11249433的腫瘤中Notch2表達的增加促進ER陽性Luminal型腫瘤的形成［6］。在體外實驗中，Notch3表達在人類祖細胞向Luminal細胞的分化過程中起到重要作用，并且Notch3受體表達的升高與具有高侵襲性的三陰性乳腺癌有關［7］。另有研究表明Notch3高表達的乳腺癌中含有較高比例的乳腺癌干細胞，其相關性依賴于細胞周期蛋白D1的正常表達［8］。

2 Notch信號通路與乳腺癌干細胞其他信號通路

Notch信號通路與其他信號通路、生長因子、細胞因子、致癌激酶以及轉錄因子間存在廣泛的聯系，包括Hedgehog、Wnt信號通路以及PI3K/AKT/mTOR信號通路等，共同調控乳腺癌干細胞的生物學行為［3］。

2.1 Hedgehog信號通路

Notch與Hedgehog信號通路均與乳腺癌細胞的自我更新及分化有關，Hedgehog信號通路已被證實能夠誘導Notch配體Jagged2表達；使用shRNA沉默Notch2及Gli1或Gli2，使Notch及Hedgehog信號通路同時抑制，能夠降低腫瘤細胞集落形成率，但單獨使用其中任意一種shRNA作用均無明顯效果［9］。另外，Hes1介導Notch導致的Gli1轉錄抑制，從而負性調節Hedgehog，抑制Notch信號通路將導致Hedgehog通路活性的上調，聯合多通路的靶向治療相對于單一治療更為有效［10］。

2.2 Wnt信號通路

研究發現，在人類乳腺上皮細胞中Wnt1表達的升高導致一系列Notch信號通路相關因子的激活，Wnt靶基因Lef1與Axin2表達的上調同時伴隨著Notch配體DLL3、DLL4表達增加；相反，阻抑Notch配體表達能夠消除Wnt1介導的乳腺上皮細胞轉化，這些結果均表明Notch與Wnt間的平衡對于乳腺癌的發生至關重要［11］。然而，Notch與Wnt在影響干細胞命運的過程中具有相反的效應，Notch促進干細胞分化，而Wnt促進其自我更新與增殖。最近的研究表明，在一些實體腫瘤中Notch也存在潛在的腫瘤抑制作用，這可能與Notch抑制Wnt信號通路的致癌性有關［12］。

2.3 PI3K/AKT/mTOR信號通路

在乳腺上皮細胞中，Notch已被證實能夠調節AKT通路，Notch1通過Hes1轉錄沉默PTEN，從而誘導PI3K/AKT通路的上調［13］。AKT的激活是Notch導致凋亡抑制的必要條件；相反，在乳腺癌細胞中抑制Notch通路將導致AKT活性，降低并促進凋亡［13］。mTOR（molecular target of rapamycin）是一個關鍵的蛋白激酶，通常作為PI3K/AKT信號通路的下游因子。使用γ-分泌酶抑制劑抑制Notch信號通路，將導致Notch以及mTOR通路的同時抑制，降低細胞增殖能力，從而達到抗腫瘤活性［14］。最近的研究表明，在三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）中Notch1、pAKT及NF-κB有顯著相關性，AKT能夠介導Notch1對NF-κB的激活作用，從而導致TNBC的增殖、侵襲與轉移，針對這3條通路的聯合治療為TNBC提供了新的治療途徑［15］。

3 Notch信號通路的臨床應用

傳統的乳腺癌治療僅針對于殺傷癌細胞，而對于具有強大自我更新能力及腫瘤形成能力的乳腺癌干細胞無明顯作用。Notch信號通路影響乳腺癌干細胞的命運，因此針對Notch的靶向藥物，包括γ-分泌酶抑制劑（γ-secretase inhibitors，GSIs）以及大分子單克隆抗體（mAbs），受到越來越多的關注，并向臨床應用方向迅速發展。

3.1 γ-分泌酶抑制劑

如前所述，Notch受體激活過程中的第3次裂解需要γ-分泌酶的催化，從而釋放Notch受體的活化形式。GSIs通過競爭性結合γ-分泌酶裂解位點抑制Notch的活性，針對乳腺癌細胞的GSIs目前有3種。

3.1.1 PF-03084014 PF-03084014能夠顯著抑制γ-分泌酶的活性，從而下調Notch信號通路，而對γ-分泌酶及其配體的表達無影響［16］。體外實驗中PF-03084014抑制癌細胞運動、內皮細胞形成以及微球體形成；體內實驗中，PF-03084014導致細胞凋亡、抑制乳腺移植瘤的增殖能力與自我更新能力、導致腫瘤血管損傷以及轉移活性的降低［16］。另外，乳腺癌動物模型研究發現PF-03084014與多西他賽具有協同作用，其作用機制為逆轉多西他賽造成的NICD上調以及NUMB（NICD的負性調控因子）的表達抑制，從而抑制多西他賽造成的Notch信號通路的激活，同時，PF-03084014能夠逆轉多西他賽引起的上皮間質轉化從而減少CSCs［17］。

3.1.2 MK-0752 MK-0752（MERK）是一種強效非競爭性口服GSIs，Ⅰ期臨床試驗證實MK-0752在實體腫瘤中能夠帶來臨床獲益，并且其毒性可以耐受［18］。最近的研究表明，MK-0752與多西他賽聯合用于局部進展或轉移性乳腺癌，多周期治療后，組織學檢查發現CD44+/CD24-、ALDH+乳腺癌干細胞以及微球體形成顯著減少［19］。該研究抑制乳腺癌干細胞自我更新與分化，治療乳腺癌有效，奠定了Notch靶向治療聯合化療的基礎。

3.1.3 RO-4929097 在三陰性乳腺癌中，BCSC被認為與腫瘤耐藥及復發有關，而BCSC中存在Notch信號通路的異常激活，從而使三陰性乳腺癌高表達Notch［15，20］。因此，針對Notch信號通路的靶向治療成為三陰性乳腺癌新的治療方向［7］。但最近的研究發現，RO-4929097明顯抑制三陰性乳腺癌的BCSC中CD44+/CD24low亞群細胞的微球體形成及異種移植瘤的生長，而CD44+/CD24neg細胞群則對RO-4929097耐藥［21］。RO-4929097有望用于對抗BCSC，但干細胞的異質性將限制其效能。

3.2 Notch信號通路單克隆抗體

另一類Notch信號通路的靶向抑制劑為Notch單克隆抗體，具有較強特異性，有望避免GSIs引起的非特異性Notch受體及其下游抑制導致的相關毒性。目前進入臨床試驗的Notch單克隆抗體為OMP-21M18、OMP-59R5及OMP52M51。OMP-21M18為DLL4抗體，阻止DLL4與Notch1、Notch4的結合。研究證實，抑制DLL4的單克隆抗體，單藥或聯合伊立替康均可減少乳腺癌干細胞比率，從而抑制腫瘤的形成［22］。OMP-59R5為選擇性的結合Notch2、Notch3受體，從而阻斷Notch信號通路。OMP52M51為選擇性抑制Notch1受體，可以抑制細胞生長及血管生成。

4 結語

綜上所述，Notch信號通路對乳腺癌干細胞的調控作用已受到廣泛關注，然而對其確切作用機制尚需展開更深入的研究。同時，Notch信號通路與其他乳腺癌干細胞調控因子間的相互作用仍需進一步探索，以發揮其在乳腺癌治療方面廣闊的應用前景。然而，GSIs以及單克隆抗體的安全性與有效性有待進一步驗證，減輕其毒性的策略亟需不斷完善。另外，特異性識別Notch受體的小干擾RNA也逐漸被證實能夠有效抑制乳腺癌干細胞，這也將成為研究Notch信號通路的又一熱點?？傊?，Notch通路抑制劑與其他治療手段，包括針對其他因子的靶向治療、細胞毒性藥物治療、放療、生物治療等抗腫瘤綜合治療，有望給Notch靶向治療乳腺癌患者帶來更加廣闊的前景。

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（2014-05-15收稿）

（2014-06-29修回）

Research progress in notch signaling pathway in breast cancer stem cells

Rong GUO,Jin ZHANG
Correspondence to:Jin ZHANG;E-mail:zhangjin@tjmuch.com

The Third Department of Breast Cancer,China Tianjin Breast Cancer Prevention,Treatment,and Research Center,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital;National Clinical Research Center of Cancer,Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy of Ministry of Education,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060, China

This work was supported by the Municipal Key Special Project of Tianjin(No.12ZCDZSY15700)

Breast cancer stem cells(BCSC)are group of cells exhibiting self-renewal and multi-directional differentiation potentials.These cells have an important role in the occurrence,development,metastasis,and recurrence of breast cancer.In normal circumstances,the ability of mammary stem cells to differentiate and undergo self-renewal is governed by related signaling pathways. After this mechanism is destroyed,breast stem cells undergo abnormal differentiation,forming breast cancer stem cells that unlimitedly proliferate to develop into breast cancer.As research on BCSC increasingly deepens,regulation of BCSC by notch signaling and its crosstalk with several signaling pathways have drawn a great deal of attention in this field.This paper reports the signaling pathways of breast cancer stem cells and latest studies on this field to better understand the essential role of notch signaling pathway in the occurrence and development of breast cancer and corresponding clinical targeted therapy.

Notch,signaling pathway,breast cancer,breast cancer stem cells,targeting therapy

10.3969/j.issn.1000-8179.20140812

郭瑢 在讀碩士研究生。研究方向為乳腺腫瘤外科。

天津醫科大學腫瘤醫院乳腺腫瘤三科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，中國天津乳腺癌防治研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，乳腺癌防治教育部重點實驗室（天津市300060）

*本文課題受天津市科技項目（編號：12ZCDZSY15700）資助

張瑾 zhangjin@tjmuch.com

E-mail：ynkmgr@126.com