乳用動物乳腺特異性miRNAs研究進展

曲波，王春梅，仇有文，袁肖寒，甄貞，姜毓君

（東北農業大學a.乳品科學教育部重點實驗室，b.生命科學與生物技術研究中心，哈爾濱150030）

0 引言

2008年12月，農業部發布的《乳用動物健康標準》中指出：“乳用動物是指用于生產供人類食用或加工用生鮮乳的奶牛、奶山羊等動物”。乳腺是乳用動物的生產器官，可以將營養素轉化為乳成分并形成乳汁。乳腺的發育涉及眾多激素和細胞因子參與。miRNAs（microRNAs）是一種廣泛存在的、對基因表達進行微調的分子，大量研究證實，miRNAs參與乳腺發育、泌乳和退化過程的諸多調節途徑[1-2]。

目前，有關miRNAs在乳腺發育和泌乳活動中作用和機制的研究還主要集中在人和小鼠等模式生物上，雖然與乳用動物乳腺特異性miRNAs有關的報道并不多，但相關的研究正逐漸成為乳腺發育與泌乳生物學研究的熱點[3]。本文就近年來奶牛與奶山羊乳腺miRNAs研究工作做一概述，為未來此領域的研究提供依據。

1 miRNAs與乳腺生物學

1.1 miRNAs 的預測與鑒定

miRNA（microRNA）是一類長約22 nt的內源非編碼小分子RNA，由長約70 nt的發夾狀前體RNA（pre-miRNA）加工而成。已有研究證實，miRNAs在轉錄后水平迅速靈敏地調節著基因的表達，廣泛參與細胞發育、分化、增殖、凋亡、代謝、腫瘤轉移等多種生物學過程[4]。

雖然miRNAs的研究歷史很短，但其進展勢頭十分迅猛，迄今miRBase收錄的miRNAs已超過3萬條。近年來，隨著miRNAs研究的深入，各種miRNAs檢測技術也是層出不窮，但主要還是分為3類。一是傳統的克隆方法，這也是最早被應用于檢測miRNAs領域的方法之一；二是新一代測序技術（next-generation sequencing，NGS），實現了高通量篩選新的miRNAs；最后是生物信息學方法，該法最具效率，應用最廣，為NGS的高通量篩選提供技術保證，已成為尋找和鑒定miRNAs及靶基因的主要方法[5]。隨著人們對miRNAs及其靶基因性質和特點的深入了解，以及物種基因組信息的完善，相信會有更多的miRNAs和靶基因被發現。

1.2 miRNAs在乳腺發育中的作用與機制

乳腺作為具有泌乳功能的哺乳動物特有器官，在其生長發育過程中經歷著細胞生長、分化、增殖、凋亡等生命過程。哺乳動物生殖周期中乳腺的功能性分化是至關重要的。乳腺發育和泌乳活動都是通過神經和內分泌系統進行調節。此外，激素和生長因子在乳腺不同階段的發育過程中起重要作用。miRNAs作為廣泛存在的轉錄后調控機制，主要靶向于信號分子、結點蛋白及信號蛋白，可能對傳統的神經和內分泌系統細胞因子水平調節引入新的調控機制。隨著miRNAs的不斷發現和深入探索，有關miRNAs對乳腺發育和泌乳功能調控的研究也逐步展開。

Sdassi等人應用克隆方法在乳腺中發現了24個乳腺發育的相關miRNAs基因并鑒定了其中6個，發現它們有一定的組織特異性[6]。李曄等發現，miR-195和miR-365對小鼠乳腺上皮細胞活性及增殖能力有抑制作用，還可降低小鼠乳腺上皮細胞乳糖分泌，抑制乳腺上皮細胞的泌乳能力[7]。李慧銘等應用脂質體轉染法結合生物信息學、熒光定量PCR等技術證明，miR-142-3p對小鼠乳腺上皮細胞活性及增殖能力有抑制作用，對小鼠乳腺上皮細胞中酪蛋白和甘油三酯的合成分泌有抑制作用，其靶基因為PRLR[8]。

乳腺組織特異性miRNs的陸續發現及其相關靶基因的確定，初步揭示了其在乳腺發育和泌乳機能分化中的調控作用，而且其調控作用可能是一種調控網絡，但目前miRNAs調控哪些細胞因子、哪些信號轉導通路，它們與信號分子的關系如何等問題，都亟待去揭示和探討。

2 乳用動物乳腺miRNAs的篩選與鑒定

2.1 奶牛乳腺miRNAs的篩選與鑒定

2009年，牛全基因組測序完成后，與奶牛健康、疾病、乳品質相關的功能基因研究逐漸成為熱點，有關奶牛乳腺miRNAs的研究也較其他反芻動物多[9]。

早在2007年，Gu等就通過克隆的方法從牛乳腺和脂肪組織中鑒定出59個不同的miRNAs。其中miR-21、miR-23a、miR-24和miR-143在奶牛乳腺組織中大量表達[10]。

相對于傳統克隆方法的費時費力，高效、快速的大規模測序技術逐漸應用到奶牛乳腺miRNAs的篩選上來。2012年，李真等以泌乳期和非泌乳期奶牛為對象，采用Solexa高通量測序技術共獲得884個奶牛乳腺miRNAs序列，其中已知序列283條，保守序列96條，新發現序列505條，同時獲得兩個時期miRNA的差異表達譜。在檢測到的69條差異miRNAs中，有45條miRNA在泌乳期表達顯著下調，表明miRNA在奶牛泌乳過程中存在重要的調控作用[11-12]。

值得注意的是，自Weber等于人母乳中篩選檢測到miRNAs以來，人母乳中已檢測到多種miRNAs[13]。近年來，有報道指出牛乳中也含有miRNAs。2012年，Izumi等通過基因芯片分別檢測健康荷斯坦牛初乳與常乳，結果共檢測到102個miRNAs，其中初乳中有100個，常乳中含53個，有51個miRNAs在初乳與常乳中都存在。該團隊還篩選出一些與免疫和發育密切相關的miRNAs進行熒光定量PCR驗證，包括miR-15b、miR-27b、miR-34a、miR-106b、miR-130a、miR-155和miR-223等，結果全部為陽性，而且初乳中的表達水平顯著高于常乳，暗示這些miRNAs與器官發育和免疫功能調節有關[14]。

2.2 奶山羊乳腺miRNAs的篩選與鑒定

山羊是最早被人類馴化的動物之一，但其基因組測序工作卻遠落后于其他家畜，這也使山羊miRNAs的研究工作極大受限。直到2012年底，山羊的基因組序列組裝才初步完成，該研究整合使用了NGS和最新的DNA單分子光學作圖技術，成功克服了山羊基因組的組裝難題，提供了首個小型反芻動物參考基因組[15]。盡管山羊基因組序列信息仍不完整，但隨著高通量技術的運用和生物信息學的迅猛發展，有關山羊乳腺miRNAs的挖掘工作還是逐步開展起來[4,16]。

2012年，Ji等以嶗山奶山羊不同發育時期乳腺為研究材料，分別構建了泌乳初期、泌乳高峰期、泌乳末期三個miRNA文庫，并用Solexa高通量技術進行測序、篩選，結果在乳腺組織中獲得已知miRNAs 336個，新miRNAs 50個，顯著差異表達miRNAs 189個，表 達 豐 度 最 高 的 包 括 let-7a、let-7b、miR-143、miR-378、miR-148a等。通過進一步的生物信息學分析共獲得68條顯著富集的信號通路，且均富集到了MAPK、Wnt、Insulin、Jak-STAT等與泌乳有關的信號通路上[17-19]。隨后，Dong等通過生物信息學方法對其中一些差異顯著的miRNAs進行了靶基因預測與分析，結果獲得了22個miRNAs的215個靶基因，預示著它們在奶山羊乳腺發育過程中具有重要的調控功能，如與乳成分合成與運輸密切相關的miR-378、miR-423-5p和miR-7等[20]。同年，Li等對西農薩能奶山羊干奶期和泌乳高峰期乳腺組織miRNAs轉錄組進行了比較研究，發現差異表達的miRNAs中包括346個保守的miRNAs和95個新miRNAs，其中表達差 異 較 高 有 miR-288、miR-199a、miR-451、miR-98、miR-247、miR-25、miR-199b、miR-128、miR-145、miR-222、miR-181b等[21]。

此外，還有一些研究團隊著眼于山羊睪丸、肌肉等特異miRNAs的鑒定工作，也都取得了較好的結果。

3 miRNAs對乳用動物乳腺發育和泌乳的影響

3.1 miRNAs對奶牛乳腺發育和泌乳的影響

奶牛乳腺發育與泌乳是一個復雜的過程，受到眾多調節因素的支配。近年來，miRNAs的調控作用越來越受到關注[22]。

大量研究證實miRNAs對奶牛乳腺發育與泌乳有調節作用。Li等利用體外細胞培養和qPCR等技術研究miR-15a在乳腺發育過程中的作用，結果發現，miR-15a的靶基因為生長激素受體，通過抑制其表達限制奶牛乳腺上皮細胞的增殖和酪蛋白的分泌[23]。Wang等發現多數miRNAs在奶牛泌乳期的表達顯著高于干乳期，比如miR-221、miR-33b、miR-31等，提示miRNAs對相關功能基因的調控與泌乳階段有關[24]。李真等證實，miR-484可靶向作用于牛己糖激酶2（Hexokinase 2,HK2）mRNA的3’UTR序列，通過抑制己糖激酶的活力，下調細胞對葡萄糖攝取能力[11]。

奶牛乳房炎是影響乳腺健康和正常生理功能的關鍵因素，目前有關miRNAs參與乳腺免疫的研究逐漸受到關注。高遷移率族蛋白（High-mobility group box protein,HMGB）是一種高度保守的核蛋白，可調節細胞免疫應答。有報道指出，在乳房炎感染的奶牛乳腺組織 中 ，參 與 調 控 HMGB3[25]的 miRNAs，包 括miR-17-5p、miR-20b和miR-93，以及調控HMGB1[26]的miR-223都出現顯著的表達下調，表明這些miRNAs可能參與到乳腺免疫活動。2012年，Naeem等研究發現，在用乳房鏈球菌感染健康乳腺組織后，miR-181a、miR-16a和 miR-31大約下調 3-5倍，miR-223上調2.5倍。此外，miR-16a和miR-31推定的靶基因與免疫系統、信號轉導相關。其中，miR-31推定的靶基因出現在細胞生長與死亡、細胞通信等生物通路，并對脂類代謝有強烈抑制作用[27]。2013年，Lawless等采用高通量測序技術檢測乳房鏈球菌感染的奶牛乳腺上皮細胞，結果發現1300條已知牛成熟miRNAs序列及20多條新miRNAs。其中，21條miRNAs在感染后表達差異顯著，生物信息分析顯示這些miRNAs在免疫系統中有重要作用?？梢?，在乳腺組織感染后，有關免疫、代謝和細胞增殖相關的信號通路都有可能部分地、在基因轉錄水平受miRNAs介導[28]。

3.2 miRNAs對奶山羊乳腺發育和泌乳的影響

盡管奶山羊具有重要的經濟價值，但相當于奶牛來說，目前關于miRNAs在奶山羊乳腺發育和泌乳過程中調控作用的研究要少得多。

2013年，紀志賓等通過高通量測序、雙熒光素酶報告基因分析法和qRT-PCR等技術分析miR-143在奶山羊乳腺發育中的作用，結果發現：miR-143及其潛在靶基因1GFBP5在不同泌乳時期乳腺組織表達趨勢相同，均在泌乳高峰期低表達。同時，miR-143可抑制乳腺上皮細胞的增殖，并促進其凋亡。進而可以推斷，miR-143可能通過調控IGFBP5表達促進乳腺細胞的凋亡，從而參與乳腺的發育與泌乳[19]。

2012年，林先滋等采用數據庫預測和自由能評估法，分析40個已知參與乳腺脂肪酸調控的基因3’-UTR上潛在的miRNA結合位點，篩選出9個可能與山羊乳腺脂肪酸代謝相關的miRNA[29]。隨后，他們通過構建重組腺病毒表達載體，在奶山羊乳腺上皮細胞中過表達mi-200a，結果引起10個與乳脂合成相關基因mRNA表達量下調，6個上調。其中脂肪酸從頭合成相關基因FASN、脂滴生成相關基因TJP47（維脂滴蛋白)及脂肪酸運輸相關基因FABP4（脂肪酸結合蛋白）降幅較大；而甘油三酯生成相關基因DGATl（甘油二脂?；D移酶1）和脂解相關基因HSL（激素敏感酯酶）則增幅靠前[30]。2013年，張犁蘋等利用qRT-PCR獲得山羊miR-200家族乳腺組織表達譜，通過分析miR-200家族各成員之間與山羊乳成分的相關性，發現miR-200家族可能對山羊乳蛋白及乳脂合成具有一定的調控作用，其中miR-200a/miR-141靶向作用于在乳脂合成中起關鍵作用的基因STAT4[31]。Lin等采用高通量測序技術大規模地挖掘泌乳期山羊乳腺miRNA，共計發現823個保守的miRNA，其中30個在乳腺中高表達，包括miR-103；在乳腺上皮細胞中過表達miR-103，會提高乳脂合成相關基因的轉錄，從而上調脂滴的形成、甘油三酯的積累及不飽和脂肪酸的比例，表明miR-103表達水平與哺乳密切相關[32]。隨后，該研究小組對miRNAs協同調控奶山羊乳腺上皮細胞中乳脂合成等問題進行了深入研究，他們選取miR-23a、miR-27b、miR-103和 miR-200a等 4個miRNAs進行分析，發現 3 對 miRNAs（miR-23a和miR-27b、miR-103 和 miR-200a、miR-27b 和miR-200a）間有較強的協同調控作用，為今后的乳脂合成分子調控網絡研究提供有效幫助[33]。

盡管關乳用動物乳腺特異性miRNAs的研究得以有效展開，但相對于人、小鼠等模式生物來說，還有很大的提升空間，乳用動物乳腺miRNAs的發現與鑒定還遠遠不夠，對其具體功能的研究也急需深入。

4 展望

乳腺是乳用動物的生產器官，可以將營養素轉化為乳成分并形成乳汁，是多產奶和產好奶的首要條件。因此，乳用動物的乳腺重在健康發育和功能正常。從人類的營養需求和動物福利出發，如何最大化地提高乳產量和乳質量又不影響泌乳乳用動物的身體健康、繁殖能力和生產壽命，一直是乳腺發育與泌乳生物學研究的重要科學使命。隨著奶牛全基因組信息的完成以及山羊全基因測序工作的有效開展，乳用動物乳腺miRNAs相關研究得以不斷深入，這必將帶動整個乳腺發育與泌乳生物學研究的快速發展，其前沿研究領域也將逐漸趨向于泌乳功能基因組學、泌乳核心信號轉導途徑及其調節研究等，進而深刻揭示乳腺發育與泌乳的基因調節機理。

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