地龍ISSR-PCR體系的建立與優化

劉 濤，張 偉，劉 娟，張 磊，周清波

(1.佳木斯大學藥學院生藥學教研室，黑龍江 佳木斯 154007；2.第二軍醫大學藥學院藥用植物學教研室，上海 200433)

地龍是一味傳統動物類中藥，具有清熱定驚，通絡平喘，利尿等功效。根據《中國藥典》2010年版的記載，環節動物門寡毛綱動物地龍分為參環毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)、通俗環毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉環毛蚓Pheretima guillelmi (Michaelsen)或櫛盲環毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥體。前一種習稱“廣地龍”，后三種習稱“滬地龍”[1]。有研究發現，有溶栓、抗菌、抗腫瘤等作用，并廣泛應用于臨床[2]。此外，在水產養殖、農業、治理環境污染、食品等方面均具有重要的經濟價值[3]。隨著地龍及其相關產品的開發，其原動物及藥材需求量正逐年快速增長。產自上海的滬地龍藥用價值較高，是公認的道地藥材，但目前市面上滬地龍藥材來源比較復雜，優劣品種混雜，特別是經過加工或者炮制過的地龍藥材，采用一般的傳統地龍藥材鑒別方法很難對其種源品質等方面進行正確的鑒別分析，嚴重影響了地龍藥材的應用與開發。

簡單重復序列間擴增(inter-simplesequence repeat,ISSR)是一種新型的分子標記技術，在PCR反應基礎上建立反應體系，與以往的隨機引物擴增多態DNA(random amplified pdymorphic DNA,RAPD)、簡單重復序列(simplesequence repeat,SSR)標記技術相比，ISSR能夠提供更多、更穩定可靠，重復性更好的基因組DNA信息[4]。目前在品種鑒定[5]、多樣性分析[6，7]等方面均有廣泛的應用研究。

現采用單因素設計試驗對影響其鑒定結果的各影響因子進行分析篩選，從而建立最佳地龍ISSR-PCR體系，為深入研究地龍藥材的遺傳多樣性提供了技術支持。

1 實驗材料

實驗所用的原材料為新鮮動物威廉環毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)，采自上海市第二軍醫大學藥用植物園，取新鮮地龍10條，將其編號，液氮速凍后置于-70℃超低溫冰箱備用，用于基因組DNA的提取及ISSR-PCR研究?；蚪MDNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司(批號：DP304)；Premix Taq聚合酶(批號：R004A)與DL2000 DNA Marker(批號：3427B)均購自寶生物工程(大連)有限公司；ISSR引物序列來自University of British Columbia發布的100個序列[8]，由上海生工生物工程有限公司合成；50×TAE緩沖液由上海生工生物工程有限公司生產。

2 實驗方法

2.1 DNA的提取與檢測

將置于-70℃超低溫冰箱中的速凍地龍樣本放入盛有液氮的研缽中，快速研磨至粉末狀，按照基因組DNA提取試劑盒提供的提取步驟對其進行DNA提取，提取完畢，經過0.8%瓊脂糖凝膠進行130V電壓電泳檢測30min，以此來判斷提取的DNA樣本是否降解，篩選有清晰條帶的樣本作為備用。使用紫外分光光度法，測定波長在260nm和280nm處的吸光度，估測DNA樣本質量，檢測λ260/.λ280值是否符合實驗要求(1.6～1.8)，將篩選好的樣本稀釋至50μg/μL的樣本保存在-20℃冰箱內，為ISSR-PCR反應備用。

2.2 ISSR-PCR反應體系建立

此次試驗應考慮的不穩定性因素有ISSR引物、Taq聚合酶、模板DNA，通過對各因素的處理與優化，從而確定ISSR-PCR最佳反應體系。反應體系和初始程序參照文獻[9]，總反應體系為20μL。反應程序為：94℃預變5min；94℃變性30s，54.6℃退火30s，72℃延伸1min，循環38次；72℃延伸10min，4℃保存。反應產物經過1.6%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電泳緩沖液為1×TBE，在50V電壓下電泳140min左右，溴化乙錠(EB)染色30min，DNA Marker(DL2000)標記，用紫外線凝膠成像分析儀(購自上海培清科技有限公司)觀測，拍照，保存。

2.3 模板DNA濃度的優化

隨機選取同一解鏈溫度(Tm=52.2℃)的8個引物用作反應引物(UBC#807、#812、#813、#816、#819、#822、#825、#828)，設定模板DNA濃度為50、25、10 μg/μL作為待篩選的模板DNA樣本，經觀察對比獲取模板DNA最佳濃度。

2.4 引物的篩選及其退火溫度的優化

將篩選好的模板DNA濃度作為體系最佳模板DNA濃度，對100條ISSR引物進行篩選，根據檢測結果選擇ISSR-PCR反應體系最佳引物，同時利用最佳體系對ISSR引物退火溫度進行梯度試驗，梯度溫度設定在引物解鏈溫度上下浮動3℃，對每個退火溫度梯度擴增的結果進行觀察對比，確定ISSR引物最佳退火溫度。

2.5 穩定性試驗

另取10份同種地龍原動物模板DNA對ISSR-PCR最佳反應體系的穩定性進行檢測，反應程序同上。

3 實驗結果

3.1 模板DNA不同濃度對ISSR-PCR反應體系的影響

如圖1所示，第1、4、7、10、13、16、19、22號均未有擴增條帶產生，表明ISSR反應體系在模板DNA濃度為50 μg/μL時均沒有發生擴增；第2、5、8、11、14、17、20、23號均能產生條帶，但清晰度與特異性較低；第3、6、9、12、15、18、21、24號擴增的條帶清晰度最好，特異性高，因此，確定10 μg/μL為ISSR反應體系模板DNA最佳濃度。

3.2 ISSR引物的篩選以及其退火溫度的優化

以圖2為例，由圖可知，第13號和第18號均未出現擴增條帶，第4、10、15、16、17號有較少的擴增條帶，第1、3、5、6、12、14號有擴增條帶，但背景不清晰，多態性低，第2、9、11號擴增的條帶背景清晰，多態性高，特異性好，因此第2號的引物807、第9號引物825和第11號的引物810被選為ISSR最佳引物，最適退火溫度分別為52.2、55.2、52.2℃。經篩選，確定引物807、810、818、825、826、827、829為ISSR反應最佳引物，以及最佳引物的最佳退火溫度，見表1。

M-Marker DL 2000；1～3、4～6、7～9、10～12、13～15、16～18、19～21、22～24對應的引物分別是807、812、813、816、819、822、825、828

1、4、7、10、13、16、19、22對應的DNA濃度為 50μg/μL，2、5、8、11、14、17、20、23是25 μg/μL，3、6、9、12、15、18、21、24對應的是10 μg/μL

圖1 模板DNA不同濃度對ISSR-PCR反應體系的影響

M-Marker DL2000；1～3、4～6、7～9、10～12、13～15、16～18對應的引物分別是807、816、825、810、814、817

1、4、7、10、13、16對應的退火溫度為49.2℃，2、5、8、11、14、17為52.2℃，3、6、9、12、15、18為55.2℃

表1 ISSR-PCR反應最佳引物及其最佳退火溫度

3.3 最佳反應體系的穩定性分析

根據確定的ISSR-PCR最佳反應體系，用10個同種地龍模板DNA進行穩定性分析試驗，從圖3的結果來看，確定的ISSR最佳反應體系穩定性高，可為后續實驗所用。

M-Marker DL2000

4 討論

ISSR分子標記鑒定技術作為一種新型的分子標記技術，具有多態性水平高，重復性好，安全性高，成本低的特點，雖然比其他鑒定分析技術更有準確性和穩定性，但仍存在多種不穩定性因素(ISSR引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA)影響著鑒定結果，因此在選用ISSR分子鑒定前期，應考慮分析各影響因素，篩選ISSR反應最佳引物，摸索ISSR引物最佳退火溫度，從而確立地龍ISSR-PCR最佳反應體系。

本實驗采用單因素設計試驗建立了ISSR-PCR最佳反應體系，通過篩選最佳引物及摸索其最佳退火溫度，從而將ISSR-PCR反應體系進一步優化。最佳反應體系為：反應總體積20μL，其中有10U Taq酶，0.8μmol/L引物，10ng/μL 模板DNA，加滅菌水補足至20μL，引物UBC807、UBC810、UBC818、UBC825、UBC826、UBC827、UBC829為ISSR反應最適引物，最適退火溫度分別為52.2、52.2、55.2、55.2、54.6、54.6、54.6℃。實驗發現，模板DNA濃度、引物及其退火溫度的選擇對ISSR反應結果有著重要的影響，為后續ISSR技術開展地龍遺傳多樣性的實驗研究提供了依據。

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