在高濃度尿素的存在下采用制備型電泳體系進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離腐植酸成分

S.KarimM.Aoyama著

劉毓芳3 吳云彬4 趙瑞華3 張彩鳳4*譯

（1 日本弘前大學農業和生命科學學院 弘前 036-8561

2 日本巖手大學農業科學聯合研究院 盛岡 020-8550

3 晉中學院化學化工學院 晉中 0306002

4 太原師范學院化學系 太原 030006)

在高濃度尿素的存在下采用制備型電泳體系進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離腐植酸成分

S.Karim1,2M.Aoyama1著

劉毓芳3吳云彬4趙瑞華3張彩鳳4*譯

（1 日本弘前大學農業和生命科學學院 弘前 036-8561

2 日本巖手大學農業科學聯合研究院 盛岡 020-8550

3 晉中學院化學化工學院 晉中 0306002

4 太原師范學院化學系 太原 030006)

采用制備型電泳體系在高濃度的尿素存在下進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離水溶性腐植酸中的不同成分。在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，根據水溶性腐植酸中深色成分分子大小的不同能夠將它們彼此分離開來，同時還可以通過酸沉淀的方法將這些深色物質重新回收。水溶性腐植酸中大部分的熒光物質分子尺寸都很小，這使得它們可以溶于酸，并且被酸溶解的熒光物質可以通過吸附在DAX-8樹脂上而重新獲得。但是，水溶性腐植酸中的非熒光物質則會在電泳過程中丟失。而那些被認為是小分子的熒光物質則會通過氫鍵的斷裂和7 M尿素的疏水作用得到分離。漫反射傅里葉變換紅外光譜的測量結果表明腐植酸中不同成分的化學性質是不同的。而實驗結果表明在高濃度尿素存在下聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離和收集水溶性腐植酸中各組分的一種很有用的方法。

熒光 腐植酸 腐殖化程度 制備電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE) 尿素

最新研究表明腐殖質是由一系列相對較小的分子結合而成的一種不均勻的物質，它來自于已死生物體的分解和降解，并且通過弱的化學作用力如氫鍵和疏水鍵連接在一起。自從知道高濃度尿素可以使腐殖質中的氫鍵和疏水鍵斷裂后，在高濃度的尿素存在下進行聚丙烯酰胺凝膠電泳就成為分離水溶性腐植酸成分的一種有效方法。而通常情況下采用的是垂直板式聚丙烯酰胺凝膠電泳。但一般卻很難收集到足夠量的樣品來描述被分離出的成分的性質。因此，在這里我們采用制備型電泳體系在高濃度尿素的存在下進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離水溶性腐植酸中的不同成分。

1 材料和方法

從新成土（Fujisaki土壤)和火山灰土（Chitose土壤)中提取腐植酸備用。

采用Nativen制備電泳體系進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，制備電泳體系由以下三部分組成—上凝膠柱、下凝膠柱和位于兩柱之間的收集部分。對水溶性腐植酸進行電泳時，上下凝膠柱均用含7 M尿素的6%聚丙烯酰胺凝膠灌注，而中間的收集部分則用pH值為8.8的含10%蔗糖的硼酸鹽緩沖溶液作為回收液。將腐植酸樣品溶于含7 M尿素（濃度為20 mg/mL)的pH=8.3的Tris-硼酸緩沖液中，并取出1 mL加入到上凝膠柱（長為50 mm，直徑為16 mm)中。然后在15 mA的恒定電流下進行電泳。每兩分鐘用餾分收集器將回收液收集到2 mL的聚丙烯管中，而剛剛收集過回收液的部分則要繼續灌注新的回收液，以上過程要重復進行60次。被收集到的回收液總共可以分為8部分，根據它們遷移率的遞減順序依次標為F1～F8。而殘留在上凝膠柱中的水溶性腐植酸則用0.1 M的氫氧化鈉溶液提取，并標為F9。然后用鹽酸對各部分進行酸化得到深色沉淀物，將這些沉淀用稀鹽酸重復清洗四次后用純水洗滌，最后低溫干燥。用鹽酸進行沉淀時，F1～F3的上清液是棕色的，因此，F1～F3的上清液中這些有顏色的組分在凝膠柱中會吸附到DAX-8樹脂上，接著可以用稀鹽酸和純水對其進行洗滌。而后將吸附在DAX-8樹脂上的棕色沉淀用0.1 M的氫氧化鈉溶液進行洗脫，得到的氫氧化鈉洗脫液則需立即通過陽離子（由氫離子組成)交換樹脂。緊接著將交換所得的氫離子飽和溶液倒入旋轉蒸發器中濃縮至適當的體積后進行低溫干燥。最后將F2和F3的懸浮液混合起來以待下一步分析。

將低溫干燥組分的一部分溶于0.1 M的氫氧化鈉溶液中，然后進行有機碳含量分析并測量其在400 nm和600 nm處的吸光度，計算A600/C和A400/C的值，這里的C指的是碳的濃度（mg/mL)，A400和A600指的是400 nm和600 nm處的吸光度值。

用高效排阻色譜（HPSEC)將低溫干燥樣品在280 nm紫外光下進行吸收檢測，在Ex=460 nm和Em=520 nm下進行熒光探測，然后再用漫反射傅里葉變換紅外光譜對其進行測量。

2 結果與討論

F1～F3中的快速遷移部分在藍光（470 nm處)下顯現出綠色的熒光，而且遷移速度越快，熒光越強（圖1)，一般來說Chitose土壤中腐植酸的綠色熒光強度要比Fujisaki土壤中的腐植酸的綠色熒光強度強。

圖1（Chitose土壤中的腐植酸)顯示的是在藍光下No.6～12管中收集的回收液，它們都可觀察到綠色熒光，No.6～12管中的組分則一起組成了F1部分。

圖1 在藍光下6～12號收集管中回收液被觀察到的綠色熒光(Chitose土壤中的腐植酸)Fig.1 Green fuorescence observed for the recovery solutions collected in the tubes No.6-12 under blue light(Chitose HA)注：6～12管中的組分組合成F1部分。

有機碳含量的分析表明F1中的大多數組分用鹽酸酸化時不會被沉淀下來（圖2)，而在F2、F3中用鹽酸酸化不產生沉淀的部分所占的比例比F1中的小。Fujisaki腐植酸中的成分主要分布在F5～F9之間，而Chitose腐植酸中的成分則主要分布在F2～F7之間。電泳部分的HPSEC表明在聚丙烯酰胺凝膠電泳中水溶性腐植酸中的各組分能夠得到分離主要是因為它們的分子大小不同，而一般來說，Fujisaki腐植酸中深色組分的分子要比Chitose腐植酸中深色組分的分子大。

圖2 電泳各餾分中碳的分布Fig.2 Carbon distribution among the electrophoretic fractions注：S為上清液；P為沉淀物。下同。

HPSEC的熒光探測結果表明，熒光探測峰值的位置與洗脫所用的洗脫液的體積有關，而與是哪一種組分無關。熒光探測峰最強的是F1的上清液，然后是F1的沉淀物和F2、F3的上清液，相反的，F4～F9的沉淀物熒光探測峰值卻很弱，因此，可以判斷，大部分的熒光物質都集中在F1的上清液中。一般來說，Chitose腐植酸的熒光探測峰值要比Fujisaki腐植酸的熒光探測峰值強，而這一點和將提取出的物質在藍光下觀察所得的結果是一致的。

相比于未進行分離的腐植酸樣品，F1～F8組分呈現出更高的A600/C值和更低的log（A400/A600)數值（圖3)。而A600/C值的增加和log（A400/A600)值的減小均表明了樣品中腐殖化程度的增加。觀察進行過電泳的部分，其腐殖化程度有所增加，這表明在高濃度的尿素存在下，對水溶性腐植酸進行凝膠電泳時，腐殖化程度低的熒光組分會從深色沉淀中分離出來。因此，F1、F2、F3的上清液的腐殖化程度要比未進行分離的腐植酸樣品低，這表明被分離出來的腐殖化程度相對較低的小分子組分可以溶于酸。另外，檢測到在上凝膠柱中殘留的腐植酸組分（F9)的腐殖化程度也較低。

圖3 已分餾和未分餾腐植酸的A600/C～log(A400/A600)圖Fig.3 log(A400/A600) versus A600/C diagram of fractionated and unfractionated HAs

對Fujisaki腐植酸來說有機碳的回收率達45%，而對Chitose腐植酸來說有機碳的回收率為63%，低的碳回收率表明在電泳時腐植酸中的相當一部分碳都丟失了。Piccolo指出在高濃度的尿素存在下水溶性腐植酸中分子較小的無色組分可以通過HPSEC被分離出來。因此，通過電泳從水溶性腐植酸中分離出來的組分可以認為其是分子較小的無色物質。而傅里葉變換紅外光譜的測量結果表明腐植酸中各組分的化學性質是不同的，對Chitose腐植酸來說，它的F1～F3上清液中所含的羧基類物質較多，而對Fujisaki腐植酸來說，除有羧基類物質外，還有更多的脂肪類和多糖類物質。在F1～F9的沉淀物中，隨著分子的增大，它們當中羧基類物質的含量會減少，而蛋白質、脂質和糖類物質的含量會增加。將電泳過的樣品和未分離的腐植酸樣品都通過紅外光譜，再將所得的結果進行比較可知，在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，水溶性腐植酸中的芳香類成分都丟失了。

因此，在高濃度尿素的存在下采用制備型電泳體系進行聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離水溶性腐植酸成分的一種很有用的方法，但是腐植酸中所含有的各種成分的化學性質則需要更詳盡的研究。

略)

譯自：Function of Natural Organic Matter in Changing Environment，2011：75～77。

Separation of Humic Acid Constituents by Polyacrylamide Gel Electrophoresis in the Presence of Concentrated Urea Using a Preparative Electrophoresis System

S. Karim1,2, M. Aoyama1write Liu Yufang3, Wu Yunbin4Zhao Ruihua3, Zhang Caifeng4*translate
(1 Faculty of Agriculture and Life Sciences, Hirosaki University, Hirosaki, 036-8561
2 The United Graduate School of Agricultural Sciences, Iwate University, Morioka, 020-8550
3 Department of Chemistry and Chemical engineering, Jinzhong University, Jinzhong, 0306002
4 Department of Chemistry, Taiyuan Normal University, Taiyuan, 030006)

To separate Humic Acid(HAs) into their constituents, Polyacrylamide Gel Electrophoresis(PAGE) was carried out in the presence of 7 M urea using a preparative electrophoresis system. Upon PAGE the dark-colored constituents of HAs were separated by their molecular sizes and recovered by precipitation with acid. Considerable parts of the fuorescent constituents of HAs with the lowest molecular size were rendered soluble in acid and the acid soluble fuorescent constituents were recovered by adsorption onto DAX-8 resin. However, the colorless constituents of HAs were lost during the electrophoresis. These constituents were considered as the low molecular sizes constituents separated due to disruption of the hydrogen bonding and hydrophobic interaction by 7 M urea. The measurement of diffuse refectioninfrared Fourier transform spectra indicated that the chemical properties of HA constituents were different from each other. The results show that preparative PAGE in the presence of concentrated urea is a useful method for fractionating and collecting the constituents of HAs.

fluorescence; humic acid; humification degree; preparative electrophoresis; polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE); urea

TQ314.1

A

1671-9212(2014)06-00028-04

國家自然科學基金(項目編號：20875059)，山西省高?？萍奸_發(項目編號：20121026)資助項目。

2014-10-08

劉毓芳，女，1963年生，副教授。主要從事分子發光分析研究。*通訊聯系人：張彩鳳，女，教授。E-mail：841322483@qq.com。