樺褐孔菌次生代謝產物清除自由基活性成分的分離純化及初步鑒定

李婉珍，潘 燕，葛 飛，樊美珍

（1.安徽工程大學，微生物發酵安徽省工程技術研究中心，安徽蕪湖241000；2.安徽省微生物防治重點實驗室，安徽合肥230036）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus（Fr.）Pilat）為多孔菌科（Polyporaceae）纖孔菌屬（Inonotus）的藥用真菌[1]。在我國主要生長在吉林、黑龍江、西藏、青海等高海拔山區的樺屬樹木上[2]。

樺褐孔菌是一種具有很高藥用價值、應用前景廣泛的真菌。近期研究結果表明，樺褐孔菌除了具有抗腫瘤[3-4]、抗病毒、降血壓、改善血液循環、調整血壓、降低血膽固醇、增強免疫的作用外，還具有清除體內自由基和明顯的抗氧化作用[5-8]。

目前，國內外有關樺褐孔菌多糖及抗氧化活性的相關研究較多[9-12]，而對樺褐孔菌菌株發酵液清除自由基活性成分分離純化研究的相關報道相對較少[13-15]，尤其是對活性組分純化合物的結構鑒定尚未見報道，本實驗以清除自由基活性為目標，對樺褐孔菌次生代謝產物中清除自由基活性成分進行研究，并采用多種分離方法對其活性組分進行分離純化，旨在分離出具有清除自由基活性的純化合物，為樺褐孔菌深層發酵產物的開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌（Inonotus obliquus（Fr.）Pilat） 由吉林應用真菌研究所提供；二苯代苦味肼基自由基（DPPH） 購于美國Sigma公司；其他試劑 為國產分析純。

B685型中壓液相色譜儀 瑞士BUCHI；Spectra M 2酶標儀 美國Molecular Devices公司；FREEZONE 12型凍干機 美國LABCONCO公司；柱層析系統 上海滬西分析儀器廠；6010型紫外-可見分光光度計 上?；萜辗治鰞x器有限公司；Waters Spherisorb ODS2型高效液相色譜（HPLC）分析柱（4.6mm×250mm，5μm）、Waters 2487型雙波長檢測器 美國Waters公司；Summetryshield RP18柱（5μm，3.9×150mm） Korean，Autocharm工作站。

1.2 實驗方法

1.2.1 樺褐孔菌發酵液乙酸乙酯脂溶相樣品的制備

本實驗將樺褐孔菌菌株發酵液濃縮至1/20倍加入3倍體積95%乙醇（乙醇終濃度為75%）醇沉，室溫下靜置24h，5000r/min離心10min，取上清液濃縮脫醇，加入3倍體積的乙酸乙酯進行萃取，待分層后得酯溶相，將酯溶相濃縮至干備用。

1.2.2 乙酸乙酯提取脂溶相清除自由基活性的定性分析 本實驗將發酵液的乙酸乙酯提取物配制成1.0mg/m L的甲醇溶液，采用二苯基苦基苯肼自由基薄層實驗法（DPPH-TLC-ASSAY）[16]進行自由基活性的定性分析。

1.2.3 清除自由基活性的測定方法 采用DPPH-酶標儀法[17]：加用95%甲醇配制的不同濃度的樣品100μL和用95%甲醇配制好的DPPH試液100μL置于96孔酶標板中，37℃條件下振蕩30s，選擇波長在517nm處測其吸光值。每樣品平行測定3次。然后按下述公式計算自由基清除率：

式中，Ap—樣品加入DPPH試液的吸光值（517nm處吸光值）；Ac—樣品不加入DPPH試液的吸光值；Amax—DPPH試液不加樣品（以95%甲醇代替）的吸光值。

1.2.4 乙酸乙酯提取脂溶相經反相柱（Summetryshield RP18）粗分 本實驗中中壓液相色譜采用硅膠含量為80g鍵合的C18的柱材料，色譜柱直徑為5cm，長度為30cm。

將待分樣品甲醇充分溶解，加到中壓液相色譜（MPLC）的加樣管中，依次采用100%雙蒸水（Ⅰ）、30%甲醇水溶液（Ⅱ）、50%甲醇水溶液（Ⅲ）、70%甲醇水溶液（Ⅳ）、100%甲醇溶液（Ⅴ）五種梯度進行洗脫。按不同梯度分別收集樣品濃縮至干，各組分樣品和DPPH分別用95%甲醇配制成濃度為1mg/m L溶液，進行清除自由基活性檢測。

1.2.5 凝膠柱層析（SephadexLH-20）法對粗分的樣品分離 制備凝膠層析柱及上樣分離[18]，調整柱流速在1滴/20s左右進行洗脫，加足流動相甲醇，用自動收集儀分管進行收集，每管控制收集5m L左右。應用TLC法對收集的樣品進行合并濃縮，分別配制濃度為0.5mg/m L甲醇溶液，DPPH用甲醇配成濃度為0.8mg/m L的試劑，進行清除自由基活性檢測。

1.2.6 硅膠柱層析法對分離樣品純化 采用干法裝柱及上樣[19]，依次采用100%石油醚、石油醚∶氯仿（10∶1）、100%氯仿、氯仿∶甲醇（100∶1）、100%甲醇洗脫劑進行梯度洗脫，以20滴/m in的流速開始洗脫，每20m L收集一管。收集到的各個組分采用TLC法分析，把相同Rf值的組分進行合并。

1.2.7 重結晶 用氯仿∶石油醚（1∶10）混合溶劑20m L溶解0.5g樣品，裝入潔凈的小玻璃管中，用封口膜封口后用小針在膜上刺幾個小孔，將小管置于干燥器或4℃冰箱中，使有機溶劑緩慢揮發7～30h。同時，在觀察時，避免晃動液體。

1.2.8 純度鑒定

1.2.8.1 薄層層析法（TLC） 本實驗對樣品LWZc采用氯仿∶甲醇（C∶M）=10∶1、氯仿∶丙酮（C∶AC）=3∶2、石油醚∶乙酸乙酯（PE∶EA）=5∶1三種不同極性的展開系統展開，樣品LWZf采用氯仿∶丙酮=3∶2展開劑展開，脫尾現象嚴重，再采用A#（氯仿∶丙酮∶甲酸=240∶160∶1）、B#（氯仿∶丙酮∶甲酸∶水=120∶80∶1∶5）兩種展開劑展開，待溶劑揮發后在254nm紫外燈下觀察熒光猝滅斑點，再在碘蒸汽條件下和10%H2SO4顯色劑條件下顯色觀察。

1.2.8.2 高效液相色譜法（HPLC） 樣品溶解于適量的甲醇（色譜級）中，然后進行HPLC純度檢驗。色譜條件：色譜柱：waters 4.6mm×250mm，紫外檢測波長：190～400nm全波長下掃描，流動相：0.005%甲酸水與甲醇（色譜級）梯度洗脫，流速：控制在0.5m L/min～1.0m L/m in。

1.2.9 結構解析

1.2.9.1 活性組分的HPLC-TOF-MS分析 將檢測到的活性組分通過HPLC-TOF-MS進一步確認分析。質譜檢測條件為：電噴霧離子源（ESI）的霧化氣壓為35psi；氮氣流速為12.0L/m in，溫度為325℃；陽離子模式離子化電壓為4000V，碎片電壓215V；陰離子模式離子化電壓為3500V，碎片電壓175V。

色譜條件：色譜柱：waters 4.6mm×250mm，紫外檢測波長：190～400nm全波長下掃描，流動相：0.005%甲酸水與甲醇（色譜級）梯度洗脫，流速：控制在0.5～1.0m L/m in。

1.2.9.2 核磁共振（1H-NMR） 采用500M核磁共振測量化合物的1H-NMR圖譜，待溶解化合物Lwzf和Lwzc的溶液自然揮發至干后，分別取樣品干粉2mg溶于氘代甲醇和氘代氯仿中，轉移至潔凈的核磁管中，在常溫下測試核磁共振1H-NMR氫譜。

2 結果與分析

2.1 乙酸乙酯提取脂溶相清除自由基活性的定性分析

乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基活性定性實驗結果如圖1所示。

圖1 清除DPPH自由基活性的定性分析Fig.1 DPPH-TCL assay of Inonotus obliquus extracts

樣品帶有多條黃色（黑白圖片中為白色）色帶呈現，說明樺褐孔菌菌株發酵液乙酸乙酯提取物中含有清除DPPH自由基的活性成分。該樣品中活性成分有一種極性較低（Rf值＞0.7）化合物，多種成分為極性較強（Rf值＜0.5）化合物。

2.2 乙酸乙酯提取脂溶相經反相柱（Summetryshield RP18）的粗分離

圖2 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ五個組分的DPPH自由基清除率Fig.2 Free radical scavenging rate ofⅠ、Ⅱ、Ⅲ、ⅣandⅤ

由圖2可以看出，5.8g樣品經反相柱的粗分離，得到Ⅰ（2.2484g）、Ⅱ（1.81534g）、Ⅲ（340.26mg）、Ⅳ（178.16mg）、Ⅴ（169.52mg）5個組分。其中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個組分都有較強的清除DPPH自由基作用，而Ⅳ、Ⅴ兩個組分幾乎沒有清除DPPH自由基的作用，Ⅰ組分極性太大通常很難分離，因此，選?、蚝廷髢蓚€組分作為進一步分離的兩個組分。

2.3 凝膠柱層析（SephadexLH-20）法對粗分樣品的分離

將粗分樣品Ⅱ和粗分樣品Ⅲ分別通過1.2.5實驗方法進一步分離，粗分樣品Ⅱ分離得出A、B、C、E、F五個組分，粗分樣品Ⅲ分離得出D組分，各組分清除DPPH自由基的活性分析見圖3。C、F組分具有較強的清除DPPH自由基的能力，其他組分清除自由基的能力較弱，選擇C和F兩組分進行硅膠柱分離和純化。

2.4 硅膠層析和重結晶對樣品的純化

對C組分樣品采用1.2.6方法進行純化，得到化合物LWZc，對F組分樣品依次采用1.2.6和1.2.7方法進行梯度洗脫和重結晶，得到化合物LWZf。對化合物LWZc和LWZf配制濃度為0.2mg/m L甲醇溶液，DPPH用甲醇配成濃度為0.4mg/m L的試劑，進行清除DPPH自由基活性的分析，對DPPH自由基的清除率分別為51.2%和71.5%。

圖3 A、B、C、D、E、F六個組分的DPPH自由基清除率Fig.3 DPPH free radical scavenging rate of A，B，C，D，E and F

2.5 純度鑒定

采用薄層層析法（TLC）和高效液相色譜法（HPLC）對LWZc和LWZf進行純度鑒定。

2.5.1 薄層層析法（TLC） LWZc和LWZf的TLC圖見圖4和圖5。由圖4、圖5可以看出，樣品LWZC、LWZf在薄層板上都只有一個斑點，可以初步認定兩種化合物均為單一化合物。

圖4 LWZC在三種不同展開劑中的TLC圖譜Fig.4 Chromatogram of the Lwzc in differentmobile phase

圖5 LWZf在兩種不同展開劑中的展開效果Fig.5 Chromatogram of the Lwzf in differentmobile phase

2.5.2 高效液相色譜法（HPLC） 通過190～400nm全波長掃描，LWZc和LWZf在254nm條件下吸收峰值高且溶劑峰干擾小，其他波段也有該物質的吸收峰（出峰時間相同），但是峰值不明顯或溶劑峰干擾大。圖6、圖7分別為樣品LWZc和LWZf在254nm條件下的吸收峰，該樣品為單一組分。

圖6 樣品LWZf的HPLC圖譜Fig.6 HPLC chromatogram of the purified components LWZf

2.6 純組分的結構解析

本文采用液質聯用結合1H核磁共振譜對化合物LWZf和LWZc的結構進行解析。

2.6.1 LWZf的結構解析

2.6.1.1 化合物LWZf的HPLC-TOF-MS圖譜分析 從HPLC-MS的HPLC圖6中可以看到一個主峰，其保留時間為3.25m in。從MS陰離子圖譜（圖8）可看出該化合物[M-H]-離子峰為137.0254，所以該化合物的分子量應為138.0254，而且從陰離子模式的MS圖譜上可以看出該物質有一個[M-COOH]-碎片峰為93.0362，說明該化合物含有一個羧基。

圖8 LWZf的陰離子液質聯用譜圖Fig.8 The HPLC-TOF-MSatlas of LWZf in negative ion condition

2.6.1.2 化合物LWZf的1H核磁共振圖譜分析 由化合物LWZf的1H-NMR圖譜（圖9）可知，化合物僅在位移值為6.8和7.8處有兩個相互偶合的峰，偶合常數8.2左右，可能是苯環上兩個偶位偶合的氫，也可能是苯環對位取代后兩組相互偶合的氫。結合液質聯用圖譜分析結果可推測出該化合物為對羥基苯甲酸，分子式為：C7H6O3。結構式為：

圖9 樣品LWZc的1H-NMRFig.9 The 1H-NMR atlas of the purified compound Lwzc

已知化合物對羥基苯甲酸為代表性酚酸類物質，能抗氧化、清除氧自由基。本實驗中對化合物LWZf的檢測結果與化合物對羥基苯甲酸的理化性質相一致，且從樺褐孔菌中分離得到該化合物是首次報道。

2.6.2 LWZc的結構解析

2.6.2.1 化合物LWZc的HPLC-TOF-MS圖譜分析 從MS陽離子質譜圖（圖10）可看出該化合物[M+H]-離子峰為284.5，所以該化合物的分子量應為283.5，根據氮規則可知，該化合物至少含有一個氮，且從該化合物分解之后的質譜圖可以看出，該化合物分解之后的陽離子離子峰為136.0313，所以該化合物被分解之后的分子量應為135.0313，且從圖11都可以看出該化合物有一個丟失了[M-COOH]-的碎片峰108.0530，說明該化合物含有一個羰基。

圖10 LWZc的陽離子質譜圖Fig.1 0 The HPLC-TOF-MSatlas of LWZc in postive ion condition

圖11 LWZc分解后陽離子質譜圖Fig.1 1 The HPLC-TOF-MSof LWZc decomposition in negative ion condition

2.6.2.2 化合物LWZc的1H核磁共振圖譜分析 由化合物LWZc的1H-NMR圖譜（圖12）可知，該化合物有一個位移值為6.21的芳氫可能是鄰位上有一個氨基，從位移值4.48推斷該化合物可能為一糖甙類化合物，且從位移值6.21、6.908、7.325推斷甙元部分可能為一個三取代苯環氫，取代的位置分別為鄰位和間位。

圖1 2樣品LWZc的1H-NMRFig.1 2 The 1H-NMR atlas of the purified compound Lwzc

綜合以上分析，可初步推斷該化合物的分子式為C13H17NO6，可能的結構式為：

該結構式是新的結構。由于缺少碳譜和二維譜圖，所以該化合物的結構式還需要進一步的驗證。

3 結論

本研究通過對樺褐孔菌發酵液中清除自由基活性成分的分離，得出兩種純化合物LWZf和LWZc，通過對LWZf和LWZc的結構式進行分析，化合物LWZf為對羥基苯甲酸，是一種代表性酚酸類物質，能抗氧化、清除氧自由基。盡管LWZf為一已知化合物，但從樺褐孔菌中分離得到該化合物是首次報道。通過對化合物LWZc可能的結構式的推測，該化合物結構可能是一種新的結構，化合物LWZc的純品清除自由基的能力相對較弱，可能是因為粗樣中含有其他成分和雜質的協同作用，也可能是在分離的過程中活性成分被氧化。

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