比色法測定原料肉新鮮度方法的建立

胡亞云，李志成，，*，梁 娜，岳田利，白連社，李 猛，黃雪隔

（1.西北農林科技大學食品科學博士后流動站，陜西楊凌712100；2.合肥美菱股份有限公司博士后工作站，安徽合肥230601）

比色法測定原料肉新鮮度方法的建立

胡亞云1，李志成1，2，*，梁 娜1，岳田利1，白連社2，李 猛2，黃雪隔1

（1.西北農林科技大學食品科學博士后流動站，陜西楊凌712100；2.合肥美菱股份有限公司博士后工作站，安徽合肥230601）

總揮發性鹽基氮（TVB-N）值是國家標準中用于評價肉質鮮度的唯一理化指標。以對二甲氨基苯甲醛（PDAB）為顯色劑，研究原料肉中TVB-N含量與吸光度的關系。結果表明，1mL的肉浸汁中加入1.8%（W/V）PDAB顯色劑4.5mL，濃鹽酸1.2mL，蒸餾水3.3mL，于80℃水浴中加熱8min，在446nm處測定其吸光度，一定范圍內吸光度與TVB-N的含量成線性關系，因此建立了比色法測定原料肉新鮮度的方法。利用PDAB比色法檢測原料肉的新鮮度，具有較高的精確度和回收率，而且快速、穩定、操作簡單，可作為國家標準中測定原料肉新鮮度的替代方法之一。

原料肉，總揮發性鹽基氮，對二甲氨基苯甲醛，比色，方法

肉類產業是農業的重要組成部分，肉類工程是重要的菜籃子工程，與人民的生活息息相關。隨著人們生活質量的提高，消費者對肉的品質衛生要求不斷提高，如何準確、快速地評定肉品的新鮮度不但是肉類企業和政府質量安全監管人員的迫切需求，也關系著廣大消費者的身體健康[1]。目前我國對肉品新鮮度的評定主要采用感官指標（色澤、黏度、彈性、氣味等）與理化標準相結合的方法[2-4]。感官方法主觀性強，不易量化；理化指標中pH和水分的測定[5-6]不能確定肉品的新鮮度，只有總揮發性鹽基氮（TVB-N）的測定是國標現行檢測方法[7-8]。國標定量方法中的半微量定氮法和微量擴散法[9-10]都存在操作要求條件高，費時費力，尤其最常用的半微量定氮法，蒸餾時間的長短、蒸汽通入量的大小、反應的強弱、反應終點的判定均對測定結果產生較大影響，不能達到快速、準確檢測的目的，而且誤差較大[8，11]。國內外也有用近紅外法和比色法測定TVB-N的報道[12-14]，但近紅外法設備投入較高，比色法氯化對硝基重氮苯法[11]試劑配制較困難，且測定結果誤差較大，乙酰丙酮-甲醛法測定前要煮沸15m in，條件劇烈，總體測定時間較長，最主要的是這兩種比色方法并沒有建立起吸光度與肉浸汁揮發性鹽基氮之間的關系式，現實中無法應用。

本實驗參照尿素的測定方法[15]，以對二甲氨基苯甲醛（PDAB）為顯色劑，研究原料肉中TVB-N值與吸光度的關系，探索比色法測定原料肉新鮮度的方法，為市場提供快速、準確、批量檢測原料肉新鮮度的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉 購于楊凌農貿市場，濃鹽酸、無水硫酸鈉、氧化鎂、硼酸、無水乙醇、甲基橙、亞甲基藍、甲基紅、對二甲氨基苯甲醛（PDAB） 均為國產分析純。

UV-1700雙光束紫外光分光光度計、UV-1240雙光束紫外光分光光度計 日本島津；ESJ60-4電子天平 0.0001g，上海九頂稱重設備系統有限公司；SB-5200T超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；101-AB電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品肉預處理 取3個不同新鮮度的切碎、混勻的豬肉樣品，1號新鮮豬肉，2號為1號常溫放置48h的不新鮮豬肉，稍有腐敗氣味，3號為1號常溫放置7d的腐敗豬肉，各30.00g，分別放入盛有300m L無氨蒸餾水中的三角瓶中（下同）400r/min振蕩浸提5min，濾紙過濾，濾液加簽標號1、2、3，置于4℃和-20℃待用。1.2.2 揮發性鹽基氮（TVB-N）含量的測定 按照國標GB/T 5009.44-2003執行[8]。實際測定1、2、3號豬肉樣品的TVB-N值分別為5.76、15.17、41.13mg/100g。其中2號肉浸汁設為標準肉浸汁。

1.2.3 PDAB比色法最大吸收波長的確定 取2個10m L的容量瓶，于樣品瓶中依次加入1m L標準肉浸汁，4m L PDAB顯色劑，2m L濃鹽酸，用蒸餾水定容到10m L，空白瓶用1m L蒸餾水取代樣品瓶中的肉浸汁，用1.0cm比色皿比色，用蒸餾水調零，然后在波長440～460nm，間隔2nm，測定樣品瓶和空白瓶的吸光度。

1.2.4 顯色劑濃度的確定 準確稱取5.00g PDAB粉末于小燒杯中，先用少量無水乙醇溶解，再轉入25m L容量瓶中，用無水乙醇定容，配制成濃度為20%的顯色劑。精密移取20%的顯色劑0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5m L置于8個10m L容量瓶中，用無水乙醇定容，配制成濃度分別為1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%、2.6%、2.8%、3.0%的顯色劑，濃度由低到高加簽標示1～8號。

取16個10m L的容量瓶，加簽標示樣品瓶1～8號和空白瓶9～16號，在樣品瓶中均加入1.0m L標準肉浸汁，在空白瓶中均加入1.0m L的蒸餾水，然后按1～8的編號次序對應加入樣品瓶1～8號和空白瓶9～16號已配制好的不同濃度的顯色劑各4m L、濃鹽酸各2m L，最后用蒸餾水定容，配制成不同PDAB用量梯度的樣品比色液和空白比色液。使用1cm比色皿，于波長440～460nm，間隔2nm，測定樣品瓶和空白瓶的吸光度。

1.2.5 顯色劑用量的確定 取10個10m L的容量瓶，分別加入1m L肉浸汁，再依次加入配制好的顯色劑1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00、5.50、 6.00m L，加入2m L濃鹽酸，蒸餾水定容。然后在波長446nm處測得吸光度，同時用蒸餾水代替肉浸汁分別做空白對照。

1.2.6 濃鹽酸用量的確定 取9個10m L的容量瓶，分別加入1m L肉浸汁，再各加入4.5m L配制好的顯色劑。然后往1～9號試管中依次加入0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80m L濃鹽酸，蒸餾水定容，在波長446nm處測得吸光度。同時用蒸餾水代替肉浸汁分別做空白對照，記錄數據。

1.2.7 顯色時間和穩定性的確定 取1m L標準肉浸汁于10m L容量瓶中，加入4.5m L顯色劑，1.2m L濃鹽酸，蒸餾水定容，80℃水浴加熱2、3、4、5、6、7、8、9、10m in，冷卻后分別于室溫下放置15、30、45、60m in，測定其在446nm處的吸光度，同時用蒸餾水代替肉浸汁做空白實驗，確定反應時間及樣液的穩定時間。

1.2.8 標準曲線繪制 取8個10m L的容量瓶，分別加入標準肉浸汁（TVB-N值15.17mg/100g）0.00、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.5m L（分別相當于0.00、0.30、0.91、1.52、2.12、2.73、3.33、3.79mg/100g的揮發性鹽基氮，國標蒸餾法測得），再各加入4.5m L配制好的顯色劑，然后各自緩慢加入濃鹽酸溶液1.2m L，蒸餾水定容到10m L，最后在80℃水浴加熱8m in，冷卻至室溫后在446nm處測定吸光度，以第一管做空白對照，以揮發性鹽基氮含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.9 精密度實驗 取肉浸汁10m L，用國標蒸餾法測得其揮發性鹽基氮含量為11.85mg/100g，按2.2制作標準曲線的條件和方法，測定吸光度，做6個平行，根據標準曲線方程計算對應的揮發性鹽基氮的含量，計算相對標準偏差。

1.2.10 加標回收率及準確度實驗 取已知TVB-N含量分別為11.85mg/100g和25.78mg/100g肉浸汁各50m L（相當于5g豬肉），分別加入TVB-N含量為15.17mg/100g肉浸汁50m L，混勻，其TVB-N含量分別為13.51mg/100g和20.48mg/100g，分別取1m L加標混合肉浸汁于10m L容量瓶中，按標準曲線制作的條件和方法測定各自的吸光度，同時用等量蒸餾水代替肉浸汁做空白對照，然后依據標準曲線方程計算對應的揮發性鹽基氮的含量，并分別與實際濃度作比較，平行測定6次。計算加標回收率及相對誤差。

加標回收率（%）=測定濃度（mg/100g）/實際濃度（mg/100g）×100

1.2.11 實際樣品的測定 取A、B、C三個未知新鮮度的豬肉浸汁濾液，分別按照本文建立的比色法和國標蒸餾法測定其揮發性鹽基氮含量，計算其相對誤差。

1.2.12 數據處理 所有實驗均做3個以上平行，采用DPS 7.55和Excel進行數據處理、制作圖表。所得結果多以均值±標準差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 PDAB比色條件的確定

2.1.1 PDAB比色法吸收波長的確定 由圖1可以看出在波長為446nm時，樣品吸光度與空白吸光度的差值最大。按照在試劑空白影響盡量低的情況下，盡可能選擇較大樣品吸光值的原則，PDAB比色法的最佳波長應該為446nm。因此，選擇446nm作為PDAB比色法測定TVB-N的最佳波長。

圖1 最佳波長的確定Fig.1 The choice of optimalwavelengths

2.1.2 顯色劑濃度的確定 由圖2可知，當顯色劑濃度為1.8%時，樣品吸光度與空白吸光度的差值最大，按照在試劑空白影響盡量低的情況下，盡可能選擇較大樣品吸光值的原則，選擇PDAB顯色劑最佳濃度為1.8%（W/V）。

圖2 顯色劑濃度的確定Fig.2 The concentration choice of chromogenic reagent

2.1.3 顯色劑用量的確定 由圖3可知，在肉浸汁和濃鹽酸用量不變的情況下，隨著PDAB顯色劑用量（1.8%，W/V）的增加，在相當寬的范圍內，樣品吸光度幾乎呈線形增加。當加入4.5m L顯色劑時，吸光度達到最大，繼續加大顯色劑用量，變化幅度很小。因此選擇PDAB顯色劑最佳用量為4.5m L。

圖3 顯色劑用量對樣品吸光度的影響Fig.3 The effectofaddition of chromogenic agenton absorbance

2.1.4 濃鹽酸用量的確定 由圖4可知，在樣品液和顯色劑加入量一致的情況下，隨著溶液酸度的增加，溶液吸光度增大，當濃鹽酸的加入量達到1.2m L時，溶液吸光度最大，繼續增大鹽酸用量，吸光度下降且會產生白色沉淀。因此，濃鹽酸的適宜加入量為1.2m L。

圖4 鹽酸用量對吸光度的影響Fig.4 The effectof addition of HCl on absorbance

2.1.5 顯色時間和穩定性的確定 由圖5可知，反應時間2～7m in時吸光值幾乎呈直線下降，7m in時趨于穩定，8～60min吸光度均很穩定，因此適合的顯色時間為8m in，穩定時間可達60m in。

圖5 顯色和穩定時間的對吸光度的影響Fig.5 The effectof chromogenic and setting time on absorbance

2.2 標準曲線繪制

由圖6可知，揮發性鹽基氮含量與吸光度成良好線性關系，線性方程為：y=9.2979x+0.2123，R2= 0.9915。

圖6 吸光度與揮發性鹽基氮含量關系Fig.6 The standard curvewhich shows the relationship between the absorbance and TVB-N content

樣液TVB-N含量在0.2～4.0mg/100g均保持良好的線性關系。由于樣品測定時稀釋了10倍，因此，樣品的TVB-N含量y=10×（9.2979x+0.2123）。

按照分光光度法的要求，以吸光度為0.002時的濃度為極限，實驗得出揮發性鹽基氮含量最低檢測限為2.31mg/100g。不同批次的原料肉最好用該批原料肉做標準肉浸汁建立吸光度與TVB-N之間的標準曲線方程，這樣誤差較小。

2.3 精密度實驗

豬肉樣品（TVB-N=11.85mg/100g）平行測定6次的結果，不論是以吸光度還是換算為TVB-N的值，其相對標準偏差（RSD）均小于5%（表1），說明比色法測定豬肉揮發性鹽基氮的方法精密度高，可靠性好，是測定肉品新鮮度的好方法。

表1 比色法測定揮發性鹽基氮的相對標準偏差Table 1 The relative standard deviation of colorimetric determination of TVB-N

2.4 準確度實驗

準確度是測定值或測定平均值與真值之間的接近程度，用誤差或相對誤差來表征。從表2可以看出，樣品總相對誤差小于5%，說明用比色法測定原料肉的TVB-N結果準確度較高。從表2還可以看出，樣品加標回收率在94.50%～104.91%之間，輔助說明測定結果準確，測定方法可行。

2.5 實際樣品的測定與驗證

按照本文建立的方法測定3個未知豬肉樣品A、B、C的吸光值，由標準曲線方程y=10×（9.2979x+0.2123），R2=0.9915計算3個樣品液中揮發性鹽基氮含量。再按國標蒸餾法測定該3個樣品的揮發性鹽基氮含量，測得結果見表3。由表3得知，與用蒸餾法測定的結果相比較，比色法測定TVB-N的值的相對誤差小于5%，標準偏差遠小于蒸餾法。而國標蒸餾法要經過蒸餾裝置安裝，通蒸汽蒸餾、餾分收集、配制混合指示劑、滴定等繁瑣步驟，單獨測定一個樣品需要1h以上，而且測定結果誤差較大。因此，用比色法測定肉中揮發性鹽基氮的含量準確度高、方便、省時，每個樣總共需不到30m in，批量檢測所需時間更少，可用于原料肉新鮮度的快速測定，可以作為國標蒸餾法的替代方法之一。

表3 三個豬肉樣品TVB-N含量的測定與驗證Table 3 Determination and verification of TVB-N of three beef samples

3 結論

建立了比色法測定原料肉新鮮度的方法。1m L的肉浸汁中加入1.8%（W/V）PDAB顯色劑4.5m L，濃鹽酸1.2m L，蒸餾水補足至10m L，于80℃水浴中加熱8m in，在446nm處測定其吸光度，吸光度與TVB-N的含量在一定范圍成線性關系。利用PDAB比色法檢測原料肉的新鮮度，具有較高的精確度和準確度，而且快速、穩定、操作簡單，可以作為國家標準中測定原料肉新鮮度的替代方法之一。

本文雖然以豬肉為樣品，建立了比色法測定原料肉新鮮度的方法，以同樣的方法還成功建立了比色測定牛肉新鮮度的方法，推斷以所測定畜禽肉種類的肉浸汁為標準肉浸汁能夠測定該畜禽肉的新鮮度，但實際是否全部適合還要進一步的實驗。另外，肉浸汁振蕩浸提、標準液的制備、標準，肉浸汁標準品的具體成分、含量、比例，不同種類畜禽、水產原料的新鮮度的標準品是否可以共用等等，還需要進一步的研究。

表2 比色法測定揮發性鹽基氮的回收率Table 2 The recovery rate of colorimetric determination of TVB-N

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Establishment of colorimetric determ ination method of raw meat freshness

HU Ya-yun1，LIZhi-cheng1，2，*，LIANG Na1，YUE Tian-li1，BAILian-she2，LIMeng2，HUANG Xue-ge1
（1.The Postdoctoral Station of Food Science，Northwest A&FUniversity，Yangling 712100，China；2.The PostdoctoralWorking Station，HefeiMeiling Co.，Ltd.，Hefei230601，China）

Total volatile basic nitrogen（TVB-N）was the unique physicaland chem ical indicators to evaluate the freshness of meat in the national standard.The p-d imethylam inobenzaldehyde（PDAB）being chromogenic reagent，the relationship between the TVB-N contentand its absorbance was studied.Colorimetric determ ination method of raw meat freshness was estab lished.The results showed that 1m L of extraction from raw meatwas added 1.8%（W/V）PDAB chromogenic agent 4.5m L，and concentrated hyd rochloric acid 1.2m L，and distilled water 3.3m L，and heated for eightm inutes in a water bath at 80℃.The relationship between the absorbance which was measured at 446nm and TVB-N content of raw meat was linear.The method of colorimetric determ ination of raw meat freshness by PDAB was estab lished，which was fast，stab le，and easy to operate and w ith high p recision and recovery.This m ight be one of the alternative formeasuring freshness of raw meat in future nationalstandards.

raw meat；totalvolatile basic nitrogen（TVB-N）；p-dimethylam inobenzaldehyde（PDAB）；colorimetric；method

TS251.7

A

1002-0306（2014）18-0059-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.003

2013－12－06 *通訊聯系人

胡亞云（1974-），女，碩士研究生，實驗師，主要從事農產品加工方面的研究。

陜西省科技統籌創新工程計劃項目（2011KTCL02-07）；合肥美菱股份有限公司博士后項目（201207031）。