胰腺癌組織SOX9的表達水平與腫瘤進展及預后的關系

孟凡斌 郭克建

胰腺癌發病率呈逐年上升趨勢，預后極差。其占美國惡性腫瘤死亡原因的第四位[1]。近年對其病因以及進展機制的研究雖然取得了一些進展，仍不足以提高其不佳的治療效果[2-3]。SOX9 ，SRY (sex determining region Y)-box 9，是SOX基因家族中的一員，胚胎期，胃、腸、肝臟、膽管及胰腺等多種器官的定向分化過程中SOX9都是必不可少的參與因子，而在成體，SOX9陽性細胞可分化為肝、膽管、小腸、胰腺上皮細胞，并向上述器官提供細胞來源[4-7]。而多項研究表明，SOX9在多種腫瘤的發生、發展中起到了關鍵的作用[8-12]。本研究通過免疫組織化學染色結合臨床病理及預后資料對比分析，結合細胞體外實驗，探究胰腺癌中SOX9的表達水平及臨床病理學意義。

材料與方法

一、材料

1.臨床病理材料 2007年1月至2011年12月中國醫科大學附屬第一醫院具有完整臨床資料的胰腺癌手術切除標本62例，其中男性46例，女性16例；年齡35～75歲，中位年齡59歲，術后病理證實均為原發性胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)。62例中，胰腺頭、頸部癌54例，體、尾部癌8例。所有病例均經隨訪，隨訪時間4～63個月。此外，因胰腺良性腫瘤或胰腺外傷而切除的正常胰腺組織標本5例，胰腺導管內乳頭狀黏液瘤(IPMN) 標本15例及胰腺癌組織中散在分布有胰腺上皮內瘤樣病變(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)標本18例也包含在本研究中。上述正常胰腺、胰腺癌、IPMN及PanIN標本均施行SOX9免疫組織化學染色觀察SOX9在組織中的表達情況。

本研究所涉及的人體標本、相關臨床數據及相關實驗已獲得中國醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準，并于取材前簽署知情同意書。

2.細胞及培養條件 人胰腺癌細胞系CAPAN-2、BxPC3及PANC-1均購自 American Type Culture Collection (ATCC)。細胞培養于含有10%胎牛血清 (FBS)、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養基中，孵育于37 ℃、含有5% CO2的細胞培養箱中。

二、實驗方法

1.免疫組織化學染色 采用免疫組織化學SP法，應用SP法免疫組織化學超敏試劑盒(兔，KIT-9706/9707/9708)?？乖迯筒捎胮H 6.0的檸檬酸緩沖液121 ℃高壓熱修復3 min，動物非免疫血清(羊)室溫封閉30 min后滴加一抗(SOX9多克隆抗體，Millipore，1∶1000；鼠抗Ki67，1∶50，Abcam；鼠抗p53 ，1∶200， Abcam； 鼠抗CEA，1∶400，Abcam；鼠抗CA19-9，1∶100，Abcam；鼠抗CD34，1∶100，Abcam)4 ℃孵育過夜。次日依次滴加二抗(生物素標記的抗兔或鼠IgG,1∶200,Vector Laboratories) 30 min及鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶37 ℃ 15 min。免疫組織化學結果判定：參考Sung[13]文獻評分方法：每張切片400倍顯微鏡下隨機選取 5個視野：①陽性細胞數：計算5個視野的陽性細胞的平均百分數分為4級：陽性細胞數1～24% 為1分；25%～49%為2分；50%～74%為3分；大于75%為4分。②染色強度：無著色0分；淺黃色1分；黃或深黃色2分；褐或棕褐色3分，上述兩項相乘為分級標準:≥4分定義為高表達，<4分定義為低表達。

2.細胞免疫熒光染色 細胞爬片至匯合度達到70%左右開始進行染色步驟。一抗為SOX9多克隆抗體(Millipore,1∶1 000)，4 ℃孵育過夜后加入二抗(驢抗兔594紅色熒光二抗，Life Technologies，A21207,1∶200)，室溫避光孵育1 h。加入0.5 μg/ml DAPI避光染色10 min后封片鏡檢、拍照。

3.QRT-PCR 采用RNA分離試劑盒Trizol 提取并純化細胞株總RNA，所有RNA樣本濃度均稀釋至1 μg/μl，根據TaKaRa逆轉錄和擴增試劑盒說明書進行逆轉錄和擴增。熒光實時PCR 反應體系25 μl(TaKaRa 2×SYBRR Pre-ix ExTaqTM 12.5 μl，100 nmol/L上、下游引物各1 μl，Cdna 2 μl，H2O 8.5 μl)，反應條件：95 ℃ 5 min變性；95 ℃ 5 s，60 ℃30 s，40個循環，所有反應均設立復孔，并以DEPC水代替模板cDNA作為陰性對照。引物均由Invitrogen公司設計、合成。SOX9上游引物：5′-GTACCCGCACTTGCACAAC-3′；下游引物：5′-TCGCTCTCGTTCAGAAGTCTC-3′；GAPDH 上游引物5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′；下游引物5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。QRT-PCR結果分析采用2-ΔΔCt法：即目標細胞株標本中SOX9的閾值循環數(CT)值與其相對應的GAPDH 的CT 值相減，得到校正CT 值。以BxPC-3細胞株為對照，其余兩種細胞株與其進行比較，比較公式：2-ΔΔCt=2-[(ΔCt目標細胞株目的基因-ΔCt內參基因)-(ΔCt對照細胞株目的基因-ΔCt內參基因)]。

三、統計學處理

采用SPSS(19.0版)統計軟件。SOX9蛋白表達水平與病人臨床病理學參數的關系采用卡方檢驗。Kaplan-Meier法單因素分析計算累積生存率。P<0.05差異有統計學意義。

結 果

一、SOX9在正常胰腺組織、IPMN、PanIN及胰腺癌中的表達情況

為了探討SOX9蛋白在正常胰腺及各種胰腺腫瘤性病變中的表達情況，我們以免疫組織化學染色方法分別對上述四種組織進行染色分析。結果表明，在上述四種組織中，SOX9均有陽性表達，且均表達在細胞核中。在正常胰腺組織，SOX9 100%(5/5)表達，主要表達于腺泡中心細胞及胰腺導管上皮細胞(圖1A)。在IPMN及PanIN，SOX9呈100%(IPMN：15/15；PanIN：18/18)的陽性表達，陽性細胞為腫瘤上皮細胞(圖1B， C)。而在胰腺癌，83.87%(52/62)在腫瘤上皮細胞呈陽性表達(圖1D)，其中高表達62.90%(39/62)(圖2A)，低/無表達37.10%(23/62) (圖2B)。上述結果表明，無論是正常胰腺、癌前病變的IPMN及PanIN，還是惡性腫瘤PDAC，SOX9均呈陽性表達。

A．正常胰腺；B．IPMN；C．PanIN；D．PDAC圖1 SOX9在正常胰腺組織、IPMN、PanIN及PDAC中的表達(免疫組織化學染色)

A．低表達；B．高表達圖2 SOX9在PDAC中的高表達及低表達(免疫組織化學染色)

二、SOX9蛋白表達水平與PDAC病人臨床病理學參數的關系

為了探討SOX9的表達水平與胰腺癌生物學行為的關系，我們對62例胰腺癌組織進行免疫組織化學染色，將SOX9在胰腺癌組織中的表達水平與腫瘤的臨床病理數據及預后資料做了統計分析，結果發現，SOX9蛋白表達水平與PDAC腫瘤浸潤深度(χ2=4.449，P=0.034)、淋巴結轉移(χ2=4.433，P=0.032)呈正相關，有統計學意義。而SOX9蛋白表達水平與年齡(P=0.196)、性別(P=0.196)、腫瘤大小(P=0.173)、腫瘤分化程度(P=0.522)、TNM分期(P=0.057)、術前血清CA19-9水平(P=0.082)、血管浸潤(P=0.381)、神經浸潤(P=0.449)、組織CA19-9表達(P=0.553)、組織Ki67表達(P=0.550)、組織CEA表達(P=0.101)、組織CD34血管表達(P=0.582)及組織P53表達(P=0.475)等均無明顯相關性。(表1)

三、SOX9蛋白表達水平與胰腺癌病人術后生存的關系

我們用Kaplan-Meier法對62例病人進行單因素分析發現：SOX9蛋白高表達PDAC病人(術后中位生存時間為12個月)較低表達者(術后中位生存時間為26個月)預后差(χ2=6.446，P=0.011)，兩者差異具有統計學意義。(圖3)

圖3 Kaplan?Meier生存曲線：SOX9蛋白表達與62例PDAC病人預后的關系

四、各種胰腺癌細胞系SOX9表達情況

為了觀察SOX9在不同分化程度及惡性程度胰腺癌細胞中的表達情況，我們選取了三種不同的胰腺癌細胞系：高分化的CAPAN-2、中分化的BxPC-3及低分化的PANC-1[14]，分別作了免疫熒光染色分析其SOX9表達比例及qRT-PCR檢測這幾種細胞系SOX9 mRNA表達水平。我們的免疫熒光染色結果顯示，這三種細胞系SOX9陽性細胞比率分別為：BxPC-3：62% ； CAPAN-2：68% ； PANC-1：92%(圖4)。而qRT-PCR結果顯示，在這三種細胞系中，低分化的PANC-1 SOX9 mRNA表達水平(23.68±3.06)明顯高于中、高分化的BXPC-3(1.00±0.02)和CAPAN-2(1.09±0.18)。

表1 SOX9蛋白表達與PDAC病人臨床病理學參數的關系

討 論

既往有研究表明，在肝、膽道及胰腺的胚胎發育過程中，SOX9陽性細胞位于這三種器官組織的生發中心，SOX9陽性始祖細胞不僅可分化為肝內外膽管上皮細胞、胰管上皮細胞，且可向上述組織提供充足的細胞來源[6]。這使得我們對SOX9在胰腺腫瘤的發生發展中是否也能起到類似作用產生了興趣。我們在以往的工作中對IPMN組織標本做的免疫組織化學染色結果[15]顯示，SOX9主要表達于呈乳頭絨毛狀增生的上皮結構的基底部，這一特點在胃型及腸型IPMN中尤其突出。由于胃型及腸型IPMN的組織構造分別與胃黏膜腺體及結腸腺瘤相似，而干細胞理論認為，消化管絨毛狀上皮結構的始祖細胞-干細胞恰恰位于其絨毛狀結構的基底部。SOX9主要表達于絨毛乳頭狀結構基底部這一特點在IPMN進展至惡性后，就逐漸消失了，SOX9陽性細胞像在胰腺癌組織中一樣，雜亂無章地散布于癌組織中，無任何規律性。SOX9在IPMN中這種特殊的表達方式，干細胞標志物CD44同樣具有，且免疫熒光染色提示SOX9與CD44可在同一細胞表達。上述研究結果提示我們，SOX9不僅在胰腺的發生及臟器正常功能的維持中發揮了至關重要的作用，同時在胰腺癌及其癌前病變的發生發展中也可能扮演了重要角色。我們的假設也在其他團隊的研究中得到了證實，Kopp 等[16]的研究發現，SOX9在胰腺腺泡細胞向導管細胞再到癌前病變PanIN的發展過程中是必不可少的，即SOX9陽性細胞極有可能是PansIN甚至是癌的前體細胞。新近發表的文獻證實，NF-κB介導的 SOX9的去甲基化導致胰腺癌干細胞侵襲能力的增加[17]。而另一項研究證明SOX9可介導缺氧依賴的相關基因表達并提高胰腺癌細胞的惡性度[18]。

A：BxPC?3；B：CAPAN?2；C：PANC?1。圖中紅色熒光為SOX9，藍色熒光為DAPI。各圖中左下角圖片為白色方框部分的放大像圖4 各種胰腺癌細胞系SOX9免疫熒光染色圖像

我們及其他團隊的研究結果均高度提示SOX9在胰腺癌的發生、發展過程中是一個關鍵因子，SOX9表達水平的高低對腫瘤的生物學行為有重要的影響。當前，多種基因的表達水平已經被用于臨床監測胰腺癌的發生、評估預后及監測復發，如CA19-9及CEA等[19-20]。因此我們希望SOX9能作為一個獨立指標應用于臨床，用來判斷胰腺癌的存在及預測其生物學行為。我們將免疫組織化學染色得到的SOX9蛋白表達水平與胰腺癌臨床病理資料進行的統計分析結果雖然提示SOX9高表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及預后相關(圖3)，但在腫瘤大小、TNM分期等其他指標中差異未有統計學意義，這可能和我們的樣本量小有關，這有待我們今后擴充樣本量后做進一步的分析。但我們的結果至少說明，SOX9的表達水平可能對胰腺癌的進展及預后有提示作用。

胰腺癌對化療藥物的廣泛耐藥是對其進行復發的防治及復發后非手術治療不理想的主要原因之一。作為目前唯一被FDA批準的應用于胰腺癌的化療藥，吉西他濱的問世為胰腺癌的治療帶來了福音。但是仍有大量的病人對吉西他濱耐藥，使得胰腺癌的內科治療效果極差，故找到控制胰腺癌對吉西他濱耐藥的作用機制，找到控制其發生發展的關鍵靶點，對解決困擾胰腺癌治療的耐藥問題至關重要。我們對三種不同分化水平的胰腺癌細胞系的體外實驗結果顯示低分化的PANC-1細胞的SOX9陽性細胞比率及SOX9 mRNA表達水平均顯著高于高、中分化的CAPAN-2及BxPC-3細胞。而有研究報道PANC-1細胞的吉西他濱耐藥能力也高于另外兩組細胞[21]。綜合這些研究結果，我們對后續研究提出了如下假設：SOX9表達水平高的胰腺癌細胞，其惡性程度高，對吉西他濱的耐藥能力也強，即SOX9很可能是控制胰腺癌細胞分化及吉西他濱耐藥的關鍵因子。這一點有待我們今后更加深入、系統的研究來做進一步的驗證。

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