UPLC-Q-TOF快速測定常見氨基酸含量

王 洋， 武利慶， 楊 屹

（1.北京化工大學，北京 100029；2.中國計量科學研究院，北京 100013）

UPLC-Q-TOF快速測定常見氨基酸含量

王 洋1， 武利慶2， 楊 屹1

（1.北京化工大學，北京 100029；2.中國計量科學研究院，北京 100013）

結合外標法或同位素稀釋質譜法，建立UPLC-Q-TOF快速定量氨基酸分析方法。在無離子對試劑及衍生化情況下，實現對樣品中氨基酸的快速測定。采用外標法測定時，14種常見氨基酸在其相應線性范圍內，r2為0.953～0.999，LOD為0.001～0.080mg/g，CV為1.4%～9.8%；采用Q-TOF外標法定量時，CV為1.5%～8.0%，誤差為-9.1%～40%；采用同位素稀釋質譜法測定各氨基酸濃度時，CV為1.4%～3.8%，誤差為-3.4%～3.7%。本方法可在2min之內完成14種氨基酸的分離和定量，大大縮短分析時間。同時由于采用高分辨的飛行時間質譜，避免檢測時離子間的相互干擾，提高測定結果的準確性，可用于蛋白質標準物質均勻性、穩定性檢驗及定量。

氨基酸；UPLC-Q-TOF；定量；外標法；同位素稀釋；質譜

0 引 言

氨基酸是蛋白質的基本組成單元，氨基酸分析是經典的蛋白質定量方法，準確測定樣品中氨基酸含量是蛋白質準確定量的前提。

目前，氨基酸的分析檢測方法主要有反相高效液相色譜法（RP-HPLC）[1]、毛細管電泳-質譜法（CE-MS）[2]、氣相色譜-質譜法（GC-MS）[3]以及液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）[4]。在采用RP-HPLC和CE作為分離手段時，往往需要將待測樣品衍生、轉化為具有紫外可見吸收或能產生熒光的物質，以便于檢測。在采用GC時，也要在柱前將待測樣品衍生為易揮發性物質才可以[5]。而衍生試劑不穩定、衍生化操作繁瑣，衍生出的副產物會干擾分析，具有重現性差、準確度低等缺陷[6]。LC-MS分析時，在流動相中加入離子對試劑可以提高氨基酸在反相色譜柱中的保留，省去衍生化的繁瑣過程；但是，離子對試劑會抑制信號強度，通常LC-MS分析時間為十幾到幾十分鐘[7-10]。

為了克服上述方法的缺點，Qu等[11]首先嘗試在不使用離子對試劑的情況下采用三重四級桿（QQQ）質譜進行氨基酸定量，此時各種氨基酸得不到充分的分離，譜峰重疊嚴重，由于質譜分辨率較低，對定性和定量分析造成了干擾。本文借助飛行時間質譜（time of flight，TOF）的高分辨能力，在不使用離子對試劑的情況下對14種常見氨基酸進行分離，克服了譜峰重疊干擾和離子歧視效應，取得了較為滿意的效果。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

nanoUPLC-Synapt G2（Waters公司）；TSQ Vantage（Thermo Fisher公司）。超純水（取自Milli-Q，MILLIPORE），乙腈（色譜純），甲酸（分析純），全氟庚酸（純度98%），三氟乙酸（色譜純），非標記氨基酸（美國Sigma Aldrich公司），標記氨基酸（美國劍橋同位素公司）。

1.2 標準溶液的配制

外標法：準確配制質量濃度為10mg/g的氨基酸標準溶液，逐級稀釋至從0.01，0.1，1，3，5mg/g小到大。另配氨基酸質量濃度約為0.1mg/g的溶液作為待測樣品。

同位素稀釋質譜法（ID-MS）：分別取1 mg/g脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和精氨酸配制成非標記混標及與其對應的標記氨基酸混標。配制成高標、低標和待定值樣品。

1.3 四級桿-飛行時間（Q-TOF）質譜實驗參數

1.4 三重四級桿（QQQ）質譜實驗參數

色譜條件：色譜柱為Agilent SB-Aq，2.1 mm×100mm；流速0.2mL/min，梯度條件見表1，A相是含0.8mmol PFHA和0.05%TFA的水溶液，B相是乙腈（表1）。采用Thermo Fisher公司的TSQ Vantage質譜多反應監測模式捕獲：苯丙氨酸（166→120），苯丙氨酸-13C9（175→128），脯氨酸（116→70），脯氨酸-13C5（121→74），纈氨酸（118→72），纈氨酸-13C5（123→76），亮氨酸（132→86），亮氨酸-D10（142→96）。

1.5 溶菌酶水解

1）準確配制質量濃度為1mg/mL蛋白溶液。

2）根據蛋白的氨基酸中纈氨酸含量，配制非標記混標、標記混標溶液。

3）取等量蛋白溶液和標記混標溶液，置于2 mL安瓿瓶中，40℃離心干燥。

4）加500 μL 6 mol/L鹽酸，氮吹2 min，封口。110℃，烘24h。

5）取出后，氮氣吹干，加500μL 0.1 mol/L鹽酸，過濾，同時配制相應的低標和高標溶液進行質譜分析。

變異系數：

式中：xi——測定結果；

n——總共實驗次數；

i——實驗編號。

誤差：

式中：c測——測出的氨基酸質量濃度；

c標準值——用氨基酸標準物質配制的氨基酸

質量濃度。

2 結果與討論

2.1 nano-UPLC-Q-TOF質譜法評價

當采用外標法進行定量時（見表2），14種氨基酸在0.01～10mg/g范圍內呈較好的線性關系，r2的范圍為 0.953～0.999，LOD 0.001～0.080 mg/g，CV 1.4%～9.8%。Q-TOF外標法定量的結果與傳統的QQQ外標法定量結果相比（見表3），Q-TOF外標法測定結果與標準值之間的的誤差范圍為-9.1%～40%，CV為1.5%～8.0%；傳統的QQQ分析方法對同種樣品分析結果的的誤差為-9.1%～20%，CV為0.13%～7.8%?？梢?，由于Q-TOF質譜檢測原理的限制，基于Q-TOF的氨基酸定量結果的準確度及重復性不如傳統的三重串聯四級桿質譜；但是，其準確度和重復性也能滿足一般的應用需求，尤其是基于Q-TOF的氨基酸定量可以在不使用離子對的情況下將14種氨基酸在2 min內出峰完畢進行定量，與文獻[7-10]相比，大大地縮短了分析時間。采用Q-TOF質譜，與文獻[11]中不添加離子對試劑的QQQ質譜法相比，Q-TOF高分辨、無離子歧視效應的優點，使得氨基酸檢測與定量更加準確。

表1 QQQ-ID-MS定量氨基酸的液相梯度條件

表2 外標法測定氨基酸得到的方法學參數

表3 兩種不同分析方法的外標法定值結果比較（n=5）

同位素稀釋質譜法（ID-MS）是一種高準確度的蛋白絕對定量方法，所以本文還對基于Q-TOF的ID-MS方法進行了研究。將蛋白質定量中常用的4種穩定氨基酸（脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸）配制成混標溶液，采用括弧法對樣品溶液中目標氨基酸的濃度進行ID-MS分析?；赒-TOF的氨基酸IDMS定量結果與傳統的QQQ質譜定量結果相比（見表4），前者與標準值之間的的誤差范圍為-3.4%～3.7%，CV為1.4%～3.8%；而后者對同種樣品IDMS定量結果的誤差為-1.4%～1.2%，CV為0.7%～2.5%?？梢?，當使用同位素標記物作為內標時，顯著提升了Q-TOF在定量方面的方法學性能，同時具備不使用離子對試劑、分析速度快的優點，可用于蛋白質標準物質的均勻性、穩定性檢驗及定值中。

表4 兩種不同分析方法的ID-MS定值結果比較（n=6）

2.2 nano-UPLC-Q-TOF IDMS方法的應用

為了檢驗nano-UPLC-Q-TOF IDMS方法在蛋白質標準物質研制中的應用，將其應用于溶菌酶標準物質的均勻性檢驗中。隨機選取7瓶標準物質，水解后通過測定水解液中纈氨酸的含量評價標準物質的瓶間均勻性，同時與QQQ質譜的的評價結果相比較，見表5和表6。兩種方法得到的溶菌酶質量濃度分別為0.891g/g和0.887g/g，經t檢驗，p=0.73457，可見兩種方法的測定結果差異不顯著；采用兩種方法均勻性檢驗統計量F值均小于查表值，說明溶菌酶樣品是均勻的，兩種方法得到的結論一致。由于QTOF質譜法的分析時間遠小于傳統的QQQ質譜方法，因此，在標準物質均勻性檢驗、穩定性檢驗等需要大量重復性實驗時，使用Q-TOF質譜法可以顯著縮短分析時間。

表5 Q-TOF質譜應用于ID-MS測定溶菌酶均勻性檢驗結果

表6 QQQ質譜應用于ID-MS測定溶菌酶均勻性檢驗結果

3 結束語

本文建立了nano-UPLC-Q-TOF質譜法快速檢測、定量樣品中氨基酸含量的方法，不需添加離子對試劑和氨基酸衍生化，操作更簡便。采用外標法測定時，14種常見氨基酸在0.01～10 mg/g范圍內r2為0.953～0.999，LOD為0.001～0.080 mg/g，CV為1.4%～9.8%。采用Q-TOF外標法定量氨基酸濃度時，CV為1.5%～8.0%，與標準值相比誤差為-9.1%～40%；采用ID-MS測定各氨基酸濃度時，CV為1.4%～3.8%，與標準值相比的誤差為-3.4%～3.7%。本方法可在2min之內完成14種氨基酸的分離和定量，大大縮短了分析時間。同時由于采用了高分辨的飛行時間質譜，避免了檢測時離子間的相互干擾，提高了測定結果的準確性。本方法與傳統QQQ質譜分析方法相比，在外標法測定氨基酸含量時雖然不如QQQ方法的準確度與重復性好，但是也能滿足一般要求；在IDMS測定氨基酸含量時，由于采用同位素內標消除了樣品前處理、離子化效率、分離過程中的系統誤差，顯著提升了基于Q-TOF定量的準確度，準確度與重復性都能控制在4%以內；在提升準確度和重復性的同時，能夠簡化流動相配制、縮短分析時間，可用于需要大量重復測定蛋白質濃度的場合，在基本不損失準確度的情況下顯著節約分析時間和分析成本，可用于蛋白質標準物質均勻性、穩定性檢驗及定值實驗等。

[1]Zhang X，Zhao T，Cheng T，et al.Rapid resolution liquid chromatography（RRLC）analysis of amino acids using pre-column derivatization[J].J Chromatogr B，2012（906）：91-95.

[2]Ueno Y，Ajito K，Kukutsu N，et al.Quantitative analysis of amino acids in dietary supplements using terahertz time-domain spectroscopy[J].Anal Sci，2011（27）：351-356.

[3]Peris-V J，Adelantado J V，Carb’o M T D，et al. Characterization of proteinaceous glues in old paintings by separation of the o-phtalaldehyde derivatives of their amino acids by liquid chromatography with fluorescence detection[J].Talanta，2006（68）：1648-1654.

[4]Shen F，Niu X，Yang D，et al.Determination of amino acids in chinese rice wine by fourier transform near-infrared spectroscopy[J].J Agric food Chem，2010（58）：9809-9816.

[5]Tripp J A，McCullagh J S O，Hedges R E M.Preparative separation of underivatized amino acids for compound-specific stable isotope analysis and radiocarbon dating of hydrolyzed bone collagen[J].J Sep Sci，2006（29）：41-48.

[6]Guo S，Duan J，Qian D，et al.Rapid determination of amino acids in fruits of ziziphus jujuba by hydrophilic interaction ultra-high-performance liquid chromatography coupled with triple-quadrupole mass spectrometry[J].J Agric food Chem，2013（61）：2709-2719.

[7]Arienzo M，Martino A D，Capasso R，et al.Analysis of carbohydrates and amino acids in vegetable waste waters by ion chromatography phytochem[J].Anal，2003（14）：74-82.

[8]Nimbalkar M S，Pai S R，Pawar N V，et al.Free amino acid profiling in grain amaranth using LC-MS/MS[J]. Food Chem，2012（134）：2565-2569.

[9]Samy S，Robinson J，Hays M D.An advanced LC-MS（Q-TOF）technique for the detection of amino acids in atmospheric aerosols[J].Anal Bioanal Chem，2011（401）：3103-3113.

[10]Zoppa M，Gallo L，Zacchello F，et al.Method for the quantification of underivatized amino acids on dry blood spots from newborn screening by HPLC-ESI-MS/MS[J]. J Chromatogr B，2006（831）：267-273.

[11]Qu J，Chen W，Luo G，et al.Rapid determination of underivatized pyroglutamic acid，glutamic acid，glutamine and other relevant amino acids in fermentation media by LC-MS-MS[J].Analyst，2002（127）：66-69.

Rapid method of quantitative detection of common amino acids with UPLC-Q-TOF

WANG Yang1，WU Li-qing2，YANG Yi1
（1.Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China；2.National Institute of Metrology，Beijing 100013，China）

In this work，a new method of UPLC-Q-TOF had been proposed for the rapid and accurate detection of common amino acids.Without derivatization and using ion-pair regent，amino acids were analyzed fast and accurately.This study could be applied with both external standard method and ID-MS.For external standard method，ther2of each amino acid was from 0.953 to 0.999，the LOD was from 0.001 mg/g to 0.080 mg/g and the CV was from 1.4%to 9.8%.For the quantitation of 14 amino acids with the external standard method，the CV was from 1.5%to 8.0% and the bias was from-9.1%to 40%compared with standard values.For ID-MS，the CV was from 1.4%to 3.8%and the bias was from-3.4%to 3.7%compared with standard values.14 common amino acids could be analyzed in 2 minutes，which reduced the analysis time greatly.With highresolution TOF mass spectrometry，this method avoids the interference of ion overlapping，which can improve the accuracy of measurement results，and will be well applied in homogeneity and stability testing of protein certified reference materials.

amino acids；UPLC-Q-TOF；quantitation；external standard；isotope dilution；mass spectrometry

O517；O629.73；O657.63；TM930.114

：A

：1674-5124（2014）05-0070-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2014.05.018

2013-12-25；

：2014-02-02

國家科技支撐計劃項目（2012BAK26B04）國家質檢總局科技項目（2013QK048，201310008）

王 洋（1988-），女，天津市人，碩士研究生，專業方向為分析化學。