斑蝥酸鈉對人食管癌細胞作用的體外實驗研究

王桂琦，熊朝暉，杜 萍，王 巖，楊光耀，馬曉靜

(1.河北省石家莊市第一醫院外科，河北 石家莊 050011；2.河北省石家莊市第一醫院麻醉科，河北 石家莊 050011)

斑蝥素為傳統中藥斑蝥的活性成分，臨床上對多種腫瘤有效，且具有升高白細胞而無骨髓抑制特點[1]。斑蝥酸鈉是斑蝥素的半合成藥物，具有抗多種腫瘤作用，并且具有升高白細胞、增加機體免疫力等作用[2-3]。與斑蝥素相比，斑蝥酸鈉的毒性、刺激性明顯減小，尤其明顯減低泌尿系統的不良反應。但目前文獻對于其抗癌機制報道較少。本研究以人食管癌Eca109細胞系為對象，初步探討斑蝥酸鈉對食管癌細胞株生長的抑制作用及其機制，旨在為臨床治療食管癌提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與藥物：RPMI 1640培養液、小牛血清,四甲基偶氮唑藍(four methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)及Rnase(美國Sigma公司),斑蝥酸鈉注射液(貴州神奇制藥有限公司)。

1.1.2 細胞與細胞培養：食管癌細胞株Eca109購自于中國醫學科學院腫瘤研究所，以含10%小牛血清的RPMI 1640培養液進行培養，置于37℃含5%的CO2孵箱中進行生長，待細胞鋪滿瓶壁70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶來消化貼壁細胞，選用對數生長期細胞用于實驗。

1.1.3 細胞流式儀：美國Becton Dickinson公司產熒光激活分選儀(FACS-420型)由河北省腫瘤研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 斑蝥酸鈉對Eca109細胞毒性劑量與時間效應實驗：Eca109細胞處于對數增殖期時，調整細胞濃度5×108/L，細胞懸液接種在12孔細胞培養板中。每孔加1mL細胞懸液與3mL含10%小牛血清的RPMI 1640液，加斑蝥酸鈉，使斑蝥酸鈉終濃度分別為1、4、10、40mg/L，并設DSMO對照組，每組設3個復孔。37℃下5%CO2培養箱中培養，分別于12、24、36、48、72h取樣。加入5mg/L MTT 溶液20μL，繼續培養4h，吸棄孔內上清液，每孔加入 DMSO 150μL，振蕩10min，使結晶充分溶解,用酶標分析儀(490nm波長)測定每孔光吸收值(OD 值)。腫瘤細胞生長抑制率(%)=(1-實驗組吸光值/對照組吸光值)×100%。細胞存活率=實驗組光吸收值/對照組光吸收值×100%。

1.2.2 斑蝥酸鈉對Eca109細胞凋亡劑量與時間效應實驗及細胞周期測定：斑蝥酸鈉濃度、作用時間同上。收集斑蝥酸鈉處理后的細胞，用不含Ca2+Mg2+的PBS洗，離心800r/min，5min，各2次，以注射器針筒取細胞沉淀并加上TB針頭，推入4℃預冷的70%酒精使細胞均勻分散，細胞固定20h以上。然后將細胞離心，調整細胞濃度為1×109/L，取500μL，加PI 50μL(50mg/L碘化物,0.1%檸檬酸鈉,0 1%氚X-100)在室溫下避光染色30min。樣品過400目網后用流式細胞儀測定，顯示凋亡細胞散點圖；細胞凋亡時在G1期左側出現近2倍體細胞群峰。同時用流式細胞儀測定細胞G1期、S期及G2+M期細胞百分數變化。每個樣品分析1×106個細胞×3平行孔。

2 結 果

2.1 斑蝥酸鈉對Eca109細胞存活的影響：隨著斑蝥酸鈉作用時間的延長，對Eca109細胞表現出的細胞不良反應亦相應增加(P<0.05),隨著藥物濃度的增加Eca109細胞存活率出現降低(P<0.05)。說明斑蝥酸鈉的作用對時間、濃度均有依賴性關系。見表1。

組別時間12h24h36h48h72h0mg/L組96.01±2.6594.65±4.3590.41±3.5464.30±4.8553.90±4.051mg/L組90.29±2.5185.59±3.0181.18±4.52 55.69±5.8145.07±6.444mg/L組86.60±1.3079.64±2.7072.80±3.62 48.46±3.0840.22±4.1810mg/L組81.17±2.9471.58±3.1366.54±5.3541.01±6.7035.20±4.4640mg/L組76.23±3.6062.60±4.9054.07±3.2739.36±5.6826.38±6.91

2.2 斑蝥酸鈉對Eca109細胞凋亡的影響：Eca109細胞在1、4mg/L斑蝥酸鈉作用后12h即可出現凋亡峰，24h達高峰；10、 40mg/L斑蝥酸鈉在藥物作用48h才出現明顯的凋亡峰。斑蝥酸鈉在10mg/L濃度時其誘導Eca109細胞凋亡的作用較其他濃度呈現明顯時間依賴性關系。見表2。

2.3 斑蝥酸鈉對Eca109細胞周期的影響：Eca109細胞經不同濃度斑蝥酸鈉作用后處于G2+M期細胞比例均出現增加,呈現G2+M期阻滯現象(P<0.05)。以40mg/L斑蝥酸鈉作用24、48h尤為明顯。見表3。

組別時間12h24h48h0mg/L組8.36±2.368.25±1.957.12±2.241mg/L組26.21±2.5816.82±2.5114.32±3.304mg/L組35.34±2.3628.32±7.1022.06±2.0610mg/L組44.09±2.9061.28±6.4531.25±4.6540mg/L組51.27±3.2579.30±5.2635.41±3.97

3 討 論

斑蝥酸鈉是一種廣譜抗癌藥，在以往的報道中單藥或聯合化療對食管癌等惡性腫瘤有一定療效[4]，因放療對于處于G2+M期腫瘤細胞殺滅作用最強，而斑蝥酸鈉能將腫瘤細胞阻滯于G2+M期，故斑蝥酸鈉聯合放療能起到“增敏”作用，提高放療治療中晚期腫瘤的療效，并降低放療反應。斑蝥為芫青科昆蟲南方大斑蝥或黃黑小斑蝥的干燥體，我國首先發現其具有抗腫瘤的特性[5]。斑蝥主要藥理成分是斑蝥素，隨著近代藥理學研究的進展，已提取、合成了一系列斑蝥酸鈉、甲基斑蝥胺等衍生物，這些衍生物與斑蝥素相比毒性大大降低，而且抗癌作用更明顯[6]。但是，從目前文獻來看，斑蝥酸鈉誘導食管癌細胞凋亡及其作用機制的報道不多[7]。本研究結果顯示，斑蝥酸鈉對Eca109細胞有較強的抑制作用，且存在時間和劑量效應關系，無論是低濃度還是高濃度斑蝥酸鈉均可將Eca109細胞阻滯于G2+M期。1、4、10、40mg/L 4個濃度斑蝥酸鈉12h均可檢測到明顯的G2+M期阻滯；24h時1、4mg/L 2個濃度的斑蝥酸鈉G2+M期阻滯已消退，而10、40mg/L斑蝥酸鈉G2+M期阻滯作用達高峰。上述結果提示低濃度的斑蝥酸鈉處理的細胞阻斷G2+M期短暫、不完全；而高濃度的斑蝥酸鈉對Eca109細胞的G2+M期阻斷作用比低濃度的作用完全且持久，并且隨著濃度增高這種阻斷作用越明顯。在G2+M期阻斷作用過去后，流式細胞儀可檢測到凋亡峰，1、4mg/L斑蝥酸鈉由于其過早越過G2+M期，12h即可檢測到凋亡峰，24h達高峰；10、40mg/L斑蝥酸鈉在藥物作用后48h才有明顯的凋亡峰，且10mg/L斑蝥酸鈉誘導的凋亡較40mg/L為高。提示低濃度的斑蝥酸鈉可能較高濃度的更易誘導細胞凋亡，高濃度斑蝥酸鈉更容易導致細胞壞死。

斑蝥酸鈉具體誘導細胞凋亡的機制尚不完全清楚；但目前對其類似物斑蝥素研究較多的是蛋白磷酸酯酶2A(protein phosphatase-2A,PP2A)的抑制劑，同時也是蛋白磷酸酯酶1(protein phosphatase-1,PP1)的抑制劑[8]。如果PP1的功能被抑制，會使一種重要的周期蛋白Rb不能去磷酸化，細胞不能完成由M到G1期的正常轉換，會出現M期阻滯等變化。而PP2A活性被抑制，會促使細胞越過G2進入M期“檢查點”，使一些復制未完成或DNA受損的細胞也進入M期，導致異常的有絲分裂，最終使細胞發生凋亡[9]。由此我們推斷，斑蝥酸鈉誘導的Eca109細胞凋亡的作用可能與使細胞發生M期阻滯有關。

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