四妙丸對高脂飲食膠原誘導關節炎大鼠血脂及關節的影響

陳 哲 楊思思 王 玉 劉亞飛 涂勝豪

1.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院中西醫結合科，湖北武漢430030；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院綜合科，湖北武漢430030

四妙丸對高脂飲食膠原誘導關節炎大鼠血脂及關節的影響

陳 哲1楊思思2王 玉1劉亞飛1涂勝豪1

1.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院中西醫結合科，湖北武漢430030；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院綜合科，湖北武漢430030

目的比較四妙丸和甲氨蝶呤對高脂飼料膠原誘導關節炎（CIA）大鼠的影響，明確四妙丸對關節炎和血脂的影響。方法選用W istar大鼠建立高脂飼料的關節炎模型，觀察四妙丸和甲氨蝶呤兩種治療4周后大鼠關節炎指數積分、滑膜HE染色以及檢測血清中血脂和炎癥因子的濃度。結果CIA大鼠經甲氨蝶呤和四妙丸治療后關節炎指數積分均明顯下降，病理切片的滑膜增生層次和炎癥細胞浸潤均明顯改善。與甲氨蝶呤組比較，四妙丸組血清中總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平明顯降低（P＜0.01），而高密度脂蛋白膽固醇則明顯升高（P＜0.01）；前炎癥因子腫瘤壞死因子-α濃度下降（P＜0.05），而白介素-17濃度則明顯升高（P＜0.05）。結論四妙丸可能兼具有抑制免疫和降低血脂的作用來阻止CIA的進展。

四妙丸；高脂飼料；膠原誘導關節炎；W istar大鼠

類風濕關節（rheumatoid arthritis，RA）是以對稱性多關節炎病變為主要臨床表現的全身性自身免疫性疾病，其特點是關節滑膜的慢性炎癥及軟骨吸收和骨質破壞，最終導致關節強直、畸形、功能的喪失。最近研究表明，RA患者心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）的發病風險明顯增加，RA患者中急性心肌梗死概率較正常人提高約1.6倍，而RA患者的平均壽命較正常人群減少15～18年，心腦血管急性事件是導致RA患者死亡的主要原因[1]。進一步研究發現，肥胖和血脂異常的RA患者比例較正常人明顯增高，易發生動脈粥樣硬化的傾向，可能是心血管事件死亡率增高的原因[2]。已有報道表明肥胖可明顯加重關節炎進展[3]。

RA屬中醫學痹證范疇，四妙丸具有清熱利濕之功效，臨床研究表明其治療活動性RA有效[4]，但其治療機制目前未見報道。本研究擬在膠原誘導關節炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型基礎上，探討四妙丸對高脂飼養CIA大鼠的血脂和關節影響，以揭示四妙丸治療RA的現代分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康清潔級Wistar大鼠60只，雌性，4～5周齡，體重（170±15）g，由華中科技大學同濟醫學院動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（鄂）2009-0005。

1.2 試藥與儀器

牛Ⅱ型膠原、不完全弗氏佐劑均購于美國Chondrex公司，甲氨蝶呤由上海信誼藥廠有限公司生產，四妙丸由吉林紫鑫藥業股份有限公司生產，大鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α、白介素（IL）-1β和IL-17 ELISA試劑盒由北京達科為公司生產，總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒均購于上海名典生物工程有限公司。半自動生化分析儀由山東高密彩虹分析儀器有限公司提供，恒低溫離心機由美國Sigma公司提供。

1.3 方法

1.3.1 動物分組選取15只大鼠給予普通飼料作為正常對照組，另45只大鼠給予高脂飼料[5]（蔗糖∶豬油∶奶粉∶雞蛋∶普通飼料=30∶20∶4∶2∶63），建立CIA模型，大鼠共成模38只，隨機分為三組，其中模型組12只，四妙丸組13只，甲氨蝶呤組13只。

1.3.2 造模方法按文獻[6]方法，將牛Ⅱ型膠原10 mg與等體積的不完全弗氏佐劑充分乳化，在無菌條件下，按每點皮下注射乳劑0.05mL，初次免疫在大鼠背上任選3點，加強免疫于2周后同法二點注射。

1.3.3 灌胃給藥初次免疫后第4周開始每天1次灌胃治療，以體重計算，四妙丸為臨床人用劑量的10倍，每只大鼠按每100克體重灌胃1mL，甲氨蝶呤按計量0.5 mg/kg灌胃給藥，同時正常對照組和模型組給予生理鹽水灌胃，各組均治療4周。

1.3.4 關節癥狀評分采用關節炎指數積分法評定[7]，評定依據為關節紅腫程度和范圍以及關節腫大和變形情況。0分：無紅腫；1分：趾關節稍紅腫，足爪或足墊單個區域炎癥；2分：關節輕度紅腫，足爪或足墊或踝關節兩個區域以上的炎癥；3分：關節中度紅腫，輕度功能障礙；4分：關節嚴重紅腫，僵直甚至畸形，嚴重功能障礙。

1.3.5 關節滑膜病理分析初次免疫后第8周處死各組大鼠，取滑膜組織，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片常規脫蠟至水，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡觀察組織形態變化。

1.3.6 血清血脂和細胞因子的檢測初次免疫后第8周，處死各組大鼠前禁食12 h，腹主動脈取血，分離血清檢測TG、TC、HDL-C和LDL-C水平，利用ELISA試劑盒檢測上清液中細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-17的含量，按照說明書操作，酶標測試儀450 nm處讀數。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

與正常對照組[（315.6±14.8）g]比較，模型組大鼠體重[（350.4±37.2）g]明顯增加（P＜0.05），而四妙丸組體重[（328.3±17.7）g]下降，較模型組和甲氨蝶呤組[（341.9±34.3）g]差異有統計學意義（P＜0.05）。造模成功后關節炎大鼠第10天開始逐漸出現關節炎癥狀，第2次免疫后關節炎癥狀持續加重，四妙丸組和甲氨蝶呤治療后關節炎癥狀較模型組明顯改善。

2.2 關節炎指數評分

隨著免疫時間延長，正常對照組大鼠關節炎指數評分差異無統計學意義（P＞0.05），模型組關節炎指數評分逐漸增加，四妙丸組和甲氨蝶呤組關節炎指數評分隨時間逐步下降，初次免疫41 d后與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠關節炎指數評分

2.3 關節炎病理切片

正常對照組大鼠滑膜組織未見明顯的新生血管及炎癥細胞浸潤，滑膜細胞呈單層規則排列。模型組大鼠的滑膜組織中光鏡下可見到淋巴組織浸潤，滑膜細胞層次增多，可達十多層，排列紊亂，毛細血管增生明顯，血管翳形成，滑膜下層纖維組織增生，膠原纖維沉著，炎癥細胞浸潤以及肉芽組織形成。四妙丸組和甲氨蝶呤組滑膜增生層次和炎癥細胞浸潤明顯減輕。見圖2。

圖2 滑膜病理切片（HE染色，×400）

2.4 各組血清中TG、TC、HDL-C和LDL-C水平比較

模型組TG、TC及LDL-C水平較正常對照組明顯增加（P＜0.01），而HDL-C明顯下降（P＜0.01）（表1）。甲氨蝶呤組與模型組比較TG、TC、HDL-C及LDL-C差異均無統計學意義（P＞0.05）；四妙丸組TC及LDL-C較模型組明顯下降（P＜0.01），而HDL-C則明顯升高（P＜0.01）；四妙丸組TC及LDL-C與甲氨蝶呤組比較明顯下降（P＜0.01），而HDL-C則明顯升高（P＜0.01）。見表2。

表1 正常對照組與模型組大鼠血脂水平比較（mmol/L，±s）

表1 正常對照組與模型組大鼠血脂水平比較（mmol/L，±s）

表2 各治療組與模型組大鼠血脂水平比較（mmol/L，±s）

表2 各治療組與模型組大鼠血脂水平比較（mmol/L，±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01；與甲氨蝶呤組比較，▲P＜0.01；TG：三酰甘油；TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇

?

2.5 各組血清中TNF-α、IL-1β和IL-17水平比較

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-17水平均明顯增高，差異有高度統計學意義（P＜0.01），見表3。與模型組比較，四妙丸組和甲氨蝶呤組各炎癥因子水平均明顯下降，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；四妙丸組與甲氨蝶呤組比較，TNF-α水平下降（P＜0.05），而IL-17水平則明顯升高（P＜0.05）。見表4。

表3 正常對照組與模型組大鼠血清炎癥因子水平比較s）

表3 正常對照組與模型組大鼠血清炎癥因子水平比較s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；TNF：腫瘤壞死因子；IL：白介素

表4 治療組與模型組大鼠血清中炎癥因子水平比較±s）

表4 治療組與模型組大鼠血清中炎癥因子水平比較±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01；與甲氨蝶呤組比較，▲P＜0.05；TNF：腫瘤壞死因子；IL：白介素

?

3 討論

RA病程中由于滑膜的慢性炎癥和血管翳形成可侵蝕多個關節的骨和軟骨組織導致關節破壞功能喪失，CIA大鼠是目前公認研究RA理想的動物模型。RA滑膜細胞及滑膜組織中浸潤的單核巨噬細胞、淋巴細胞等產生大量的細胞因子，這些細胞因子通過作用于多種細胞并相互調節，形成一個復雜的網絡，促進了RA的發生和發展。在RA細胞因子相互作用網絡中，IL-1和TNF-α處于中心位置，二者均能促進滑膜及軟骨細胞產生膠原酶和前列腺素E2而致關節破壞，局部的免疫復合物和游離膠原等又促使IL-1和TNF-α合成增加，加重炎癥損傷，其在RA發病中起著重要作用[8]。IL-17是一種強大的前炎癥細胞因子，也是炎性反應的微調因子，由Th17細胞分泌產生，IL-17可通過上調軟骨細胞及滑膜成纖維細胞基質金屬蛋白酶（MMP-1/3/13）的表達，進而增強聚合素酶及膠原酶活性，促進軟骨蛋白多糖和膠原降解，抑制軟骨細胞蛋白多糖的合成，并可增強單核細胞對軟骨基質的破壞[9]。

最近有文獻報道，肥胖可能是RA發展的風險因子，肥胖人群發病率的提高可能直接導致RA發病率的升高[10]。此外，肥胖會導致RA病情預后更差，一方面是心腦血管疾病的并發癥風險增高，另一方面可能對抗風濕病藥物（disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs）的治療反應下降[11-13]。降血脂他汀類藥物常用于控制高膽固醇血癥、心血管疾病和炎癥患者的脂質代謝紊亂，因為其具有抗炎、抗氧化劑、免疫調節和抗血栓作用。有臨床研究顯示，阿伐他汀具有改善RA患者關節炎癥狀的作用[14-15]。

四妙丸出自于清代張秉成《成方便讀》，由二妙丸加入牛膝、薏苡仁化栽而來。四妙丸中蒼術苦而溫，芳香而燥，直達中州，為燥濕健脾之主藥；黃柏為苦寒下降之品，入肝腎清下焦之濕熱；牛膝補肝腎強筋骨，領蒼術、黃柏入下焦而祛濕熱也；薏苡仁獨入陽明經，祛濕熱而利筋絡。諸藥相合清流潔源，標本兼顧，具有清熱利濕、宣痹通絡之功，使濕熱得除，諸癥自愈[16]。

本研究通過建立高脂CIA大鼠做對照，同時設立正常大鼠進行比較，結果發現高脂飼料的CIA大鼠血清中血脂TC、TG和LDL-C水平較普通飼料大鼠均明顯增高（P＜0.01），而HDL-C明顯降低（P＜0.01）；與此同時，膠原免疫后關節炎評分明顯高于正常組，分別給予甲氨蝶呤和四妙丸治療后，關節炎指數評分明顯下降，免疫后41 d與CIA模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；滑膜病理學積分證實給藥組的滑膜細胞增生、血管翳形成和炎癥細胞浸潤明顯下降；血清中血脂指標檢測發現，四妙丸組大鼠TC和LDL-C水平明顯下降，而HDL-C水平明顯升高，與甲氨蝶呤組比較差異有統計學意義（P＜0.01）；四妙丸組治療后血清中前炎癥因子TNF-α與甲氨蝶呤組治療后比較明顯下降（P＜0.05），但IL-17水平卻明顯高于甲氨蝶呤組（P＜0.05）。

四妙丸治療RA的機制可能是通過以下途徑實現的：①四妙丸中黃柏、蒼術、薏苡仁、牛膝均具有調節免疫抗炎鎮痛作用能阻斷炎癥細胞因子網絡的“瀑布效應”，阻斷關節病變進程。②高脂血癥和肥胖是RA的風險因子，二者均可加重RA病情，而四妙丸通過健脾祛濕的方法可明顯改善血脂異常，進而改善RA的關節炎癥狀。③四妙丸與甲氨蝶呤相比，其針對改善炎癥因子TNF-α的作用更強，進一步說明了TNF-α可能是肥胖和關節炎的中軸性作用靶點，但多個免疫因子和免疫細胞參與了RA的發展，針對單一因子治療不能根本控制炎癥的發展和預后。

總之，本研究通過比較四妙丸和甲氨蝶呤治療高脂CIA大鼠的關節炎及血清中炎癥因子的變化，發現二者均能改善CIA關節炎進程，而四妙散兼具有改善血脂的作用，這將有助于對RA發生機制進一步認識，同時為指導RA治療和預防提供了更加科學的實驗依據。

[1]Semb AG，Kvien TK，Aastveit AH，et al.Lipids，myocardial infarction and ischaemic stroke in patientswith rheumatoid arthritis in the Apolipoprotein-related Mortality RISk（AM ORIS）Study[J].Ann Rheum Dis，2010，69（11）：1996-2001.

[2]Stavropoulos-Kalinoglou A，MetsiosGS，Panoulas VF，etal. Associations of obesity with modifiable risk factors for the development of cardiovascular disease in patients with rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis，2009，68（2）：242-245.

[3]Jhun JY，Yoon BY，Park MK，et al.Obesity aggravates the joint inflammation in a collagen-induced arthritismodel through deviation to Th17 differentiation[J].Exp MolMed，2012，44（7）：424-431.

[4]楊波，梁清華，吳丹，等.四妙丸聯合西藥治療活動期類風濕關節炎20例臨床觀察[J].中醫雜志，2011，52（18）：1566-1569.

[5]龔艷琳，陸付耳，董慧，等.交泰丸及其單味藥對大鼠2型糖尿病的治療作用[J].中國醫院藥學雜志，2010，30（5）：356-360.

[6]Trentham DE，Townes AS，Kang AH.Autoimmunity to typeⅡcollagen an experimentalmodelofarthritis[J].JExp Med，1977，146（3）：857-868.

[7]湯文璐，李俊，徐叔云，等.Ⅱ型膠原關節炎動物模型的研究概況[J].中國藥理學報，1998，14（6）：495-498.

[8]岳燕林，劉劍平，蔣紅，等.乙酰唑胺對類風濕關節炎滑膜細胞增殖及TNF-α及IL-1β的影響[J].免疫學雜志，2013，29（9）：826-828.

[9]趙婷，郭亞春，高亞賢，等.薯茵皂昔元含藥血清對IL-17和TNF-α誘導大鼠滑膜細胞株RSC-364 NF-κB、AP-1的影響[J].中華中醫藥雜志，2013，28（9）：2794-2797.

[10]Crowson CS，Therneau TM，Davis JM，etal.Contribution of obesity to the rise in incidence of rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Care Res（Hoboken），2013，65（1）：71-77.

[11]Ajeganova S，Andersson ML，Hafstrmo I，et al.Association ofobesitywith worsediseaseseverity in rheumatoid arthritisaswellaswith comorbidities：a long-term followup from disease onset[J].Arthritis Care Res，2013，65（1）：78-87.

[12]Klaasen R，Wijbrandts CA，Gerlag DM，et al.Bodymass index and clinical response to infliximab in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum，2011，63（2）：359-364.

[13]Gremese E，Carletto A，Padovan M，et al.Obesity and reduction of the response rate to anti-tumor necrosis factor αin rheumatoid arthritis：an approach to a personalized medicine[J].Arthritis Care Res，2013，65（1）：94-100.

[14]Mccarey DW，Mcinnes IB，Madhok R，etal.TrialofAtorvastatin in Rheumatoid Arthritis（TARA）：double-blind，randomised placebo-controlled trial[J].Lancet，2004，363（9426）：2015-2021.

[15]徐素粉，趙福濤，趙浩，等.FasL基因關節腔內轉染對佐劑性關節炎大鼠滑膜細胞凋亡的影響[J].醫學綜述，2012，18（3）：443-445.

[16]王曉玉，張曉蘭，張麗，等.四妙丸對大鼠佐劑性關節炎作用機制的研究[J].中國中藥雜志，2010，35（21）：2889-2892.

Effects of Sim iao Pills on blood lipid and joints of high-fat diet collageninduced arthritis rats

CHEN Zhe1YANG Sisi2WANG Yu1LIU Yafei1TU Shenghao1
1.Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology,Hubei Province,Wuhan 430030,China;2.Department of Comprehensive,Tongji Hospital Affiliated to TongjiMedical College of Huazhong University of Science and Technology,HubeiProvince,Wuhan 430030,China

Objective To determine the effects of Simiao Pills on arthritis and blood lipids by comparing the influences of Simiao Pills and Methotrexate(MTX)on high fat diet collagen-induced arthritis(CIA)rats.Methods The arthritis modelwas established with high fat diet in Wistar rats.The rat arthritis index points and synovial HE staining were observed after 4 weeks of Simiao Pills and MTX treatment as well as the concentration of serum lipids and inflammatory factors were detected.Results The arthritis index score of CIA rats decreased significantly in both MTX and Simiao Pills treatment group.The synovial proliferation level and infiltration of inflammatory cells significantly improved in pathological sections.In Simiao Pills group,the serum TC,LDL-C levels decreased significantly compared with that in MTX group(P＜0.01),while the HDL-C level increased significantly(P＜0.01);the concentration of proinflammatory cytokine factor TNF-αdecreased(P＜0.05),the concentration of IL-17 significantly increased(P＜0.05).Conclusion Simiao Pills can both suppress the immune and lower the blood lipid to prevent the progress of CIA.

Simiao Pills;High fat diet;Collagen-induced arthritis;Wistar rats

R593.22

A

1673-7210（2014）01（b）-0024-04

2013-11-06本文編輯：程銘）

陳哲（1980.10-），男，博士；研究方向：中西醫結合風濕病學。

涂勝豪（1965.11-），男，教授，主任醫師；研究方向：中西醫結合風濕病學。