分子印跡仿生光子晶體的制備及其在己烯雌酚檢測中的應用

賽娜，吳蘊棠，孫忠，高志賢，黃國偉，*

（1.天津醫科大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，天津300070；2.軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所天津市環境與食品安全監控技術重點實驗室，天津300050）

分子印跡仿生光子晶體的制備及其在己烯雌酚檢測中的應用

賽娜1，吳蘊棠1，孫忠1，高志賢2，*，黃國偉1，*

（1.天津醫科大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，天津300070；2.軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所天津市環境與食品安全監控技術重點實驗室，天津300050）

探討分子印跡仿生光子晶體的制備及其在己烯雌酚殘留檢測應用的可行性。方法采用懸浮聚合法、垂直沉降法等方法制備出性能穩定的分子印跡仿生光子晶體。結果分子印跡仿生光子晶體對己烯雌酚殘留最低響應濃度為10 ng/mL，并展現出較高的響應特異性。結論將分子印跡技術與光子晶體結合可發展出一種高性能檢測材料，即分子印跡仿生光子晶體，不僅具有制備簡單、制備材料低廉等優勢而且具有較高的檢測性能。

己烯雌酚；分子印跡；仿生光子晶體；響應

己烯雌酚（diethylstibestrol，DES）是一種雌性激素，在醫學臨床上普遍用于婦科病的治療，如子宮炎、流產等。隨著其生產性能不斷提高，己烯雌酚也在畜牧、水產養殖業中得到了廣泛的應用。而從1971年起，人們逐漸發現己烯雌酚殘留對人體存在一系列的毒副作用，如長期食用含有己烯雌酚殘留的牛肉會引起幼女早熟，甚至還可能引發癌癥[1-2]。因此，世界各國和衛生組織逐漸開始關注己烯雌酚殘留控制，并將己烯雌酚列為食品性動物中禁止使用的獸藥。然而，在強大經濟利益的驅使下，濫用己烯雌酚的現象依然存在。目前檢測己烯雌酚的方法有免疫法、色譜法等[3-4]。盡管這些方法具有高靈敏度，高特性等檢測特點，但也存在一些不足，如設備昂貴，過程復雜，操作繁瑣等。因此，發展一種簡單、易行、成本低、高靈敏度的檢測方法十分必要。

光子晶體是一種介電常數在空間呈周期性變化的材料，由于其具有可控制光傳播方向的特性而使得它在傳感器，臨床診斷，生物醫學等諸多方面有著廣闊的應用前景。自1997年Asher等開發了新型光子晶體化學智能傳感材料以來，響應不同外界環境（甲基對硫磷，Pb2+，Cu2+，肌氨酸酐，葡萄糖等）的光子晶體材料的研究工作逐漸展開。他們采用對丙烯酰胺凝膠光子晶體中添加冠醚功能化的方法制備了檢測Pb2+和Cu2+的傳感器[5-7]。但是利用這種方法設計一個對特定目標具有傳感性能的材料時，必須尋找一種特殊的識別單元（例如：抗體對抗原的識別，冠醚對金屬離子的識別等），然而并不是每一個目標分子都能找到如此成熟的識別單元與之相匹配[8]。

本文以己烯雌酚作為檢測目標物，將分子印跡技術引入到光子晶體的骨架結構中，以建立一種新的光學檢測方法，并嘗試提出“分子印跡仿生光子晶體”這一概念。該材料可將分子印跡聚合物對己烯雌酚的特異性識別過程通過光子晶體光學性能變化進行傳導表達，進而達到操作簡便、快速且靈敏的殘留物檢測目的。

1 材料和方法

1.1 材料

己烯雌酚購自北京普天同創生物科技有限公司。甲基丙烯酸甲酯（MMA），過硫酸鉀（KPS）等常用化學試劑均購自天津大學科威公司。恒溫水箱購自華北分析儀器廠。光纖光譜儀HL-2000購自美國OCEANOPTICSS公司。環境掃描電鏡ESEMXL30購自Phillips公司。

1.2 方法

1.2.1 分子印跡PMMA微球制備

稱取35mg己烯雌酚加入1.5mLMMA中，于室溫下震蕩1 h后于冰箱（4℃）中靜置過夜，使己烯雌酚與MMA充分作用。將上述混合液與13mL去離子水混合于四口燒瓶中。加入0.03 g的KPS作為引發劑到上述混合液中，氮氣的保護下80℃水浴攪拌（300 r/min）反應。反應結束后將所制得的乳液冷卻至室溫，離心后用去離子重新震蕩超聲分散，重復5次后將所得的己烯雌酚印跡PMMA顆粒分散在去離子水中進行保存。

在對照實驗中，采用上述相同的制備了非印跡的PMMA微球，區別在僅于制備微球反應液中不含有己烯雌酚。

1.2.2 分子印跡仿生光子晶體的制備

將10mL己烯雌酚分子印跡PMMA微球乳液與140mL去離子水混合，超聲分散35min。用來生長光子晶體的載玻片用濃硫酸：H2O2（v/v=7∶3）浸泡處理過夜，再用去離子水沖洗，氮氣吹干后放入玻璃器皿中，將分散好的己烯雌酚印跡PMMA微球倒入玻璃器皿中，放置在恒溫恒濕箱內。5 d后即可得到分子印跡仿生光子晶體。按同樣方法制備非印跡光子晶體，區別在使用非印跡PMMA微球乳液。

1.2.3 分子印跡仿生光子晶體的固定與模板分子洗脫

將固定膜的一面緊貼于己烯雌酚印跡仿生光子晶體表面，使其完全貼合。然后緩慢剝離固定膜。此時，己烯雌酚印跡仿生光子晶體以反轉入固定膜表面。用冰乙酸和甲醇混合液（v/v=1∶20）溶液反復沖洗修飾后的固定膜，以洗掉模板分子（己烯雌酚），直至洗脫液中檢測不到模板分子，再用甲醇沖洗固定膜，以洗去過量的冰乙酸，最后浸泡于去離子水中保存。

1.2.4 檢測程序

將修飾后的固定膜另一面反貼于檢測池內，附有敏感層（分子印跡仿生光子晶體）的一面與檢測液接觸。在檢測池內加入2mL緩沖液作為背景溶液，移入隔光箱內，將光譜光源探頭浸沒于液面以下，設置檢測參數。待光學性能穩定后，加入不同濃度的己烯雌酚溶液，觀察相應出現一系列光波變化。

1.2.5 紫外光譜分析

取一系列5mL離心管，分別配制0.04mmol/L己烯雌酚，0.04mmol/LMMA以及其混合溶液4℃冰箱中靜置過夜后掃描吸收光譜并在適當波長下測得吸光度。

1.2.6 表征方法

紫外-可見吸收光譜儀以測試雌二醇印跡仿生光子晶體的Bragg衍射光譜；Phillips ESEM-XL30對己烯雌酚印跡仿生光子晶體表面形態進行分析；TLL-C臺式速凍冷凍離心機用以對顆粒進行分離純化。

2 結果與分析

2.1 己烯雌酚與MMA間相互作用

研究分子間作用力的分析技術有紫外光譜、紅外光譜和核磁共振等方法，其中紫外光譜法因其設備簡單，操作方便，成為研究分子印跡組分作用力的重要的分析方法。將己烯雌酚和功能單體（MMA）混合前后紫外信號進行比較，以了解己烯雌酚與功能單體間的相互作用。

模板分子和單體乙腈混合液紫外吸收疊加值，即理論值之和的最大吸收峰值，與模板分子和單體乙腈混合液的紫外洗漱峰值差別越大，說明該功能單體與模板分子的相互作用越強[9]。從180 nm～350 nm范圍掃描的UV譜圖中發現譜圖吸收帶發生變化的范圍集中在短波190 nm~300 nm之間，故研究了這一波段波譜的變化。紫外分光光度法研究結果如圖1所示。

圖1 己烯雌酚對MMA相互作用紫外光光譜圖分析Fig.1 Thespectrogramsof the interaction between DESand MMA

結果表明己烯雌酚和單體混合前后的吸光度值均發生了變化，說明己烯雌酚與MMA在體系中發生了相互作用。因此，MMA適作為用于己烯雌酚檢測的分子印跡聚合單體。

2.2 分子印跡仿生光子晶體形態特征

從圖2a中可以看到，分子印跡仿生光子晶體正面具有緊密堆積的結構和較好的周期習慣，空位缺陷較少，結構十分規整。同時，從微球缺失的孔洞中（紅色框內）可以推斷出，該光子晶體為面心立方結構。Woodcock[10]等曾提出，在球模型中，小球堆積成面心立方結構要比堆積成六角密堆結構結構時的能量低0.5RT/mol，因此面心立方結構是一種最為穩定的堆積結構。由此可見，該分子印跡仿生光子晶體具有較為穩定的晶體結構。從圖2b中，可以得出分子印跡仿生光子晶體具有在可視范圍內明亮而單一的結構色。當光通過光子晶體材料，將發生強烈的衍射效應從而出現衍射峰。其衍射峰波長的位置為572 nm，如圖2c。

圖2 分子印跡仿生光子晶體的（a）SEM圖片，（b）結構色圖，（c）光譜圖Fig.2（a）SEMiMages，（b）optical response，and（c）reflection spectruMof themolecular imprinted bionic photonic crystal

2.2 檢測特性

2.2.1 檢測靈敏度

圖3展示了分子印跡仿生光子晶體和非印跡仿生光子晶體對于溶液中己稀雌酚濃度的響應。從圖2中可以得知，分子印跡仿生光子晶體可隨著溶液中己烯雌酚含量的變化發生光學性能的改變。其最低響應濃度為1 0 ng/mL。而同時，非印跡光子晶體對目標分子沒有明顯響應，其Bragg衍射峰強度基本沒有降低。因此我們可以確定，該材料的檢測性源于乙烯雌酚印跡所致。

圖3 分子印跡仿生光子晶體和非印跡光子晶體對己烯雌酚的響應對比圖Fig.3 Plotsof the Bragg shiftof theMolecular iMprinted bionic photonic crystaland thenon-imp rinted bionic photonic crystal with diethylstibestrolat various concentrations.

2.2.2 檢測特異性

特異性對于檢測方法來說是一項重要指標，在檢測過程中檢測物的結構類似物不可避免的存在，因此除了分析待測物在分子印跡仿生光子晶體上的響應，還要分析己烯雌酚結構類似物在分子印跡仿生光子晶體上的響應。在一系列相同濃度條件下，分別測定它們在傳感器上的響應性（表1）。

表1 分子印跡仿生光子晶體對不同目標分子的選擇性Table1 Optical responseof themolecular imp rinted bionic photonic crystal to other analogues

3 結論

將分子印跡技術引用于光子晶體中，可發展出一種全新的殘留檢測材料——分子印跡仿生光子晶體。該材料可將分子印跡對目標物的識別過程通過光子晶體本身的光學性能變化而展現，不僅拓寬了光子晶體的應用范圍，而且對污染物的檢測方法提供了新的思路。

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The Fabrication of Molecular IMprinted Bionic Photonic Crystal for the Detection of Diethylstilbestrol

SAINa1，WUYun-tang1，SUN Zhong1，GAOZhi-xian2，*，HUANGGuo-wei1，*
（1.DepartmentofNutrition and Food Hygiene，Schoolof Public Health，Tianjin MedicalUniversity，Tianjin 300070，China；2.Tianjin Key Laboratory ofRisk Assessmenfand Control Technology for Environmentand Food Safety，Institute ofHealth and EnvironmentMedicine，Tianjin 300050，China）

Molecular imprinted bionic photonic crystals was synthesized and applied in the detection of diethylstilbestrol residues.Molecularimprinted bionic photonic crystalswith high performanceswere fabricated by thesuspensionpolymerizationand theverticalsettlement.Molecular imprinted bionic photonic crystalsshowed the high sensitivity（as low as10 ng/mL）and specificity.Based on the combination ofmolecular imprinting technique with photonic crystals，a high-performance detectionmaterials，namelymolecularly imprinted bionic photonic crystal，canbedeveloped，exhibitingnotonlysimple，inexpensivepreparationbutalsohighdetectionperformance.

diethylstibestrol；molecular imprinting；bionic photonic crystal；response

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.020

2014-09-15

國家自然科學基金青年科學基金項目（81302430）；中國博士后科學基金面上資助項目（2014M560192）；天津市高等學?？萍及l展基金（20110143）

賽娜（1983—），女（蒙古），講師，博士，研究方向：營養與食品衛生學。

*通信作者：黃國偉（1962—），男（漢），教授，博士，研究方向：營養與食品衛生學。高志賢（1966—），男（漢），研究員，博士，研究方向：營養與食品衛生學。