不同報告時間結核分枝桿菌藥物敏感性試驗結果不一致的原因

谷蘊婷 于霞 李云絮 趙立平 王桂榮 陳素婷 黃海榮

結核病是全球嚴重的公共衛生問題，結核病疫情不但在發展中國家繼續惡化,在許多發達國家也呈現回升趨勢。目前全球已有20億人感染結核分枝桿菌，而活動性結核病患者達1500萬例，每年新增結核病患者約800～1000萬例，每年有180萬例因結核病死亡[1]。耐多藥(multidrug-resistant, MDR)結核病和廣泛耐多藥(extensively drug-resistant, XDR)結核病的出現對藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)的準確性和可重復性提出了更高的要求[2-4]。INH是一種重要的一線抗結核藥物，也是診斷MDR的藥物之一，因此準確認定是否INH耐藥對于患者的臨床轉歸非常重要。

以羅氏(L-J)培養基為基礎的藥敏試驗是一個在全世界范圍內廣泛使用的方法，尤其是在發展中國家。羅氏培養基常用的方法包括絕對濃度法和比例法，這兩種方法的報告時間分別為4周和6周。國內臨床機構多采用絕對濃度法藥敏試驗，在日常的絕對濃度法藥敏試驗臨床檢驗工作中，個別菌株在含INH培養基上4周時無菌落生長而延長至6周后又有菌落生長。為了明確上述菌落形成的原因及其耐藥性，本研究收集符合上述情況的菌株做進一步研究。

材料和方法

一、材料和試劑來源

1.菌株來源：首都醫科大學附屬北京胸科醫院國家結核病臨床實驗室于2010年1—6月進行絕對濃度法藥敏試驗的菌株為546株，在37 ℃培養4周后，244株菌株對INH耐藥[低度耐藥和高度耐藥臨界值分別為0.2 μg/ml 和 1 μg/ml。收集絕對濃度法37 ℃含INH的L-J培養基上培養4周時無菌落生長、時間延長至6周后生長的13株菌株(含藥培養基延遲生長菌株)，其中4株在INH濃度為1 μg/ml的培養基上有延遲生長，7株在在INH濃度為0.2 μg/ml的培養基上有延遲生長，2株在上述2個INH濃度的培養基上都有生長。這些菌株來源于11例結核病患者(2例患者的菌株在低濃度和高濃度INH培養基上均有菌落生長)；同時收集這11例結核病患者的臨床敏感株作為對照菌株。共計24株菌株，此24株菌株均經過16S RNA和16S～23S間區序列測序后確定為結核分枝桿菌復合群。本研究經本院倫理委員會審查通過，所有患者均已簽署知情同意書。

2.試劑和儀器：標準株H37RV來源于北京胸科醫院參比實驗室。2×PCR Taq MasterMix購自北京康為世紀生物科技有限公司；所用引物由上海生物工程技術服務有限公司合成；尼龍膜(Biodyne C)購自美國Pall Biosupport 公司；抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶結合物(streptavidin-peroxidase conjugate)和CDP-Star檢測試劑購自美國GE公司。

二、方法

1．菌種鑒定：將含INH培養基上生長的13株菌株和普通羅氏培養基上生長的11株臨床敏感菌株傳代，在37 ℃培養3周，至有菌落生長。對傳代培養的菌株進行水煮法粗提DNA，然后PCR擴增其16S RNA和16S～23S間區序列進行菌種鑒定[5-7]。引物序列和擴增條件見參考文獻[8]。16S RNA 產物約800 bp, 16S～23S間區序列約400～600 bp，擴增產物由北京擎科新業生物技術有限公司進行測序。對比美國國立生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI) BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)在線數據庫中的標準株確定其菌種。

2．菌株分型和突變分析：(1)間隔區寡核苷酸分型(spacer oligo-nucleotide typing, spoligotyping)檢測：利用spoligotyping進行菌株的基因分型，操作方法如文獻[9-10]所述。(2)分枝桿菌散在分布重復單位(Mycobacterium interspersed repetitive unit，MIRU)分型法：采用Cowan等[11]的方法，選擇12位點，進行測定分析。(3)耐藥基因突變測定：PCR擴增與異煙肼耐藥相關的基因片段katG和inhA，后進行測序分析，具體操作參考文獻[12]。

3．比例法藥敏試驗：對收集的24株菌株均進行比例法藥敏試驗，以確定其對INH的敏感性，INH藥物濃度為0.2 μg/ml,具體操作參照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[13]進行。

4．不同比例混合菌株在不同報告時間的絕對濃度法藥敏試驗：為了探討混合感染對藥敏試驗的影響，進行人工模擬不同比例INH敏感菌株和耐藥菌株的混合，觀察不同報告時間(4周和6周)，藥敏試驗結果是否出現差異。選擇對照菌株和含藥培養基延遲生長菌株MRIU分型不同的3例菌株(7019H0.2,7285H0.2和7325H1)，分別與H37Rv按照以下比例混合：100∶0；1∶2；1∶4；1∶8；1∶16；1∶32；1∶64；1∶128；1∶256；0∶100。藥敏試驗采用絕對濃度法，INH濃度分別為1 μg/ml、0.2 μg/ml。具體操作參照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[13]進行。

5.質量控制(簡稱“質控”)：質控均以標準株H37Rv和陰性對照進行。對于不合理的質控結果，采取重新檢測質控樣品再次進行實驗。

三、資料收集及數據處理

電話隨訪所納入的11例患者在首次就診后的2年內是否再次入院，以及再次就診時絕對濃度法藥敏試驗中對INH的耐藥情況。涉及的數據采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。

結 果

1.菌株分型和耐藥基因突變情況:間隔區寡核苷酸分型顯示僅有3株表現為非北京基因型，其余21株均為北京基因型。MIRU分型顯示11例患者中有5例患者的對照菌株和分型不同。13株含藥培養基延遲生長菌株中10株存在S315T突變。編號9,10,11的患者對照菌株和含藥培養基延遲生長菌株spoligotying分型不一致。具體基因分型和耐藥突變情況(表1)。

2.比例法藥敏試驗: 比例法藥敏試驗結果顯示13株含藥培養基延遲生長菌株均為INH耐藥，而11株對照菌株均為INH敏感。

3.混合菌株在不同報告時間的絕對濃度法藥敏試驗結果: 當H37Rv與7325H1按不同比例混合后，比例為1∶128和1∶256的混合菌株在4周后在培養基上沒有菌落生長；而6周菌落數低濃度INH培養基的菌落數分別為29和12；高濃度INH的菌落數分別為6和3。H37Rv與7019H0.2按不同比例混合后，比例為1∶64、1∶128和1∶256的混合菌株在4周后低濃度INH培養基的菌落數分別為15、10和3；6周后的菌落數分別為50、20和11(表2)。

表1 納入的11例患者的分型和耐藥突變結果

4.隨訪結果:11例患者中有3例在本次就診后2年內再次入院，均為菌陽患者且絕對濃度法藥敏試驗均顯示對INH耐藥。具體患者信息和隨訪信息見表3。

表2 人工混合感染模型4周和6周的藥敏試驗結果

表3 納入的11例患者的基本信息和隨訪信息

討 論

中國是結核病高負擔國家，全國結核病耐藥性基線調查報告顯示，初治患者和復治患者INH的耐藥率分別為16%和38.5%[14]。本研究樣本收集期間，收集菌株中對INH的耐藥率已經達到44.7% (244/546)。本研究納入的11例患者中,有3例患者在本次就診后2年內再次入院的藥敏試驗結果證實為對INH耐藥, 且這3例患者均使用INH進行抗結核治療。本研究結果同時表明，13株含藥培養基延遲生長菌株通過比例法藥敏試驗均證實為對INH耐藥的菌株。提示在國內結核病高耐藥的背景下，應該高度警惕對INH耐藥的假陰性現象。

盡管絕對濃度法藥敏試驗包括對硝基苯甲酸(PNB)鑒定，但有部分非結核分枝桿菌會對500 μg/ml 的PNB敏感[15]。本研究為了排除非結核分枝桿菌的影響，利用PCR對菌株做了菌種鑒定，并利用spoligotyping技術對24株待測菌株做了基因分型。結果顯示，11株來自普通羅氏培養基生長的對照株和13株含藥培養基延遲生長菌株均為結核分枝桿菌復合群，其中僅有3株表現為非北京基因型，其余21株均為北京基因型。

有研究顯示，平均17%高發病率地區的新發結核病患者均為多重感染[16]。Shen 等[17]研究表明，在上海52例復發的結核病患者中，32例(32/52，61.5%)患者第一次和第二次感染的菌株屬于不同的型別。這個結果表明，外原性再感染在高發病國家很常見。本研究spoligotying 分型結果表明，11例患者中3例患者對照株和含藥培養基延遲生長菌株擁有不同的型別，其中2例患者的含藥培養基延遲生長菌株屬于北京基因型而對照培養基為其他分型，另外1株正好相反；MIRU分型結果提示，11例患者中5例患者中的對照株和含藥培養基延遲生長菌株擁有不同的型別，提示這5例患者同時感染了對INH耐藥和敏感的2種菌株，既患者的一份痰標本中包含著2種不同比例的對INH耐藥和敏感的菌株。選擇3株對照株和含藥培養基延遲生長菌株MIRU分型不同的菌株，與結核分枝桿菌標準株H37Rv按照不同比例混合后，觀察不同報告時間的藥敏試驗結果。結果證實，當耐藥菌株的比例較低，如耐藥與敏感菌株的比例小于1∶128時，就可能會出現含INH培養基4周時無菌落生長而6周后有菌落生長的情況。

細菌在長期的藥物作用下會出現耐藥突變[18]。因此，本研究中的含藥培養基延遲生長菌株的生長延遲現象可能由體外耐藥突變引起。Viveiros等[18]研究表明，經體外誘導對INH高度耐藥的菌株并不存在katG基因S315T突變。該研究選擇H37Rv和8株對INH敏感的臨床分離株，通過在剛剛低于最低抑菌濃度(MIC)的藥物濃度中培養，經過6代后，這些菌株對INH的MIC值均>20 μg/ml。而本研究中，10株(10/13, 76.92%)菌株存在S315T突變，僅將報告時間延長2周似乎不足以誘導細菌在體外發生S315T突變，因此可以推斷本研究中部分伴有S315T突變的含藥培養基延遲生長菌株可能源于體內,但是也不能排除外來感染的可能性。

本研究僅選擇INH作為代表藥物來解釋對于敏感菌株延長藥敏試驗時間的必要性。由于這樣的菌株數量很少，所以很難獲得一個大量的樣本。本研究的目的是解釋一個現象，因此樣本的數量可能足夠。

綜上所述，INH作為主要的抗結核藥物之一，其藥敏試驗的準確性對于治療至關重要。對于同一患者的藥敏試驗結果的不一致，尤其是前一份結果耐藥，后一份結果敏感的情況，應該警惕耐藥結果的假陰性。本研究中，大約2% (11/546) 的患者在延長藥敏試驗報告時間后菌株對INH由敏感變成耐藥。如果延長2周的孵育時間，會導致這部分患者的治療方案發生變化。

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