牦牛β-防御素5基因的原核表達及表達產物的抑菌活性

符 梅，熊顯榮，蘭道亮，李 鍵

(西南民族大學 生命科學與技術學院，動物遺傳育種重點實驗室，四川 成都 610041)

牦牛生活在青藏高原3 000～5 000 m海拔的高寒地帶，是高原地區牧民的主要經濟來源，其對低溫、低氧、低壓的高原環境有較強的適應能力，能充分利用其他家畜難以利用的高山草原環境[1]。良好的高原生態環境保障了牦牛奶天然、綠色的品質，純凈的奶源環境造就了綠色的牦牛奶。哺乳類動物防御素是一類廣泛存在于哺乳類動物體中的內源性抗微生物肽，在宿主天然免疫過程中發揮著重要的作用，當機體受外源病原體入侵時，可以激活機體的第一道防御屏障，啟動機體先天性免疫反應和獲得性免疫反應。防御素除具有廣譜的抗細菌活性外，還對真菌、病毒等具有一定的抗性，且與一些傳統抗生素等具有協同抗微生物的作用。因其對機體無毒副作用，所以研究哺乳類動物防御素在體內、外的抗菌作用及其機理具有重要意義。防御素(Defensin)最早是由美國科學家Lehrer等[2]于1993年發現并命名的，并從人的嗜中性白細胞中分離純化得到3種陽離子小肽，發現其具有特殊的生物學活性及功能。依據其半胱氨酸殘基位置及二硫鍵連接方式的不同，防御素可分為α、β和θ 3大類[3]。β-防御素(β-defensins)是肽抗生素中較為重要的一種，是具有廣譜抗菌活性的多功能肽，其抗菌譜包括革蘭氏陰性、陽性菌，病毒和真菌[4-5]。 Diamond等[6]于1991年首次在牛的氣管黏膜上皮細胞中發現β-防御素，并將其命名為TAP，之后又在牛的舌黏膜上皮中發現了舌抗菌肽LAP。1993年，Selsted等[7]從牛的中性粒細胞中分離了13種β-防御素(BNBD1～BNBD13)。研究表明，TAP、LAP、BNBD1～BNBD13等β-防御素對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、克雷伯肺炎桿菌、綠膿桿菌和念珠菌屬等乳房炎病原菌有抗菌活性[8]。Goldammer等[9]研究發現，在患乳房炎奶牛的乳腺組織中，β-防御素5的表達量是平時的4～13倍；原位雜交顯示，病原微生物可誘導局部感染區的乳腺上皮細胞內的β-防御素5的表達上升，進一步證明β-防御素5在奶牛乳房炎的發生、預防過程中具有重要作用[10]。到目前為止，尚未見到關于牦牛β-防御素5方面的報道。本研究構建了牦牛β-防御素5(BNBD5)基因的原核表達載體pET32-BNBD5，誘導BNBD5融合蛋白在大腸桿菌中表達，并對其表達產物的抗菌生物活性進行評價，以期為防御素替代抗生素成為新型的抗菌藥物提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)購自天根(北京)公司。金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coli)由西南民族大學動物遺傳育種重點實驗室保存。pMD19-T克隆載體購自TaKaRa(大連)公司，pET-32a(+)表達載體購自Novagen公司。RNA提取Trizol試劑盒購自Invitrogen公司，凝膠回收試劑盒購自Axygen(北京)公司，反轉錄試劑盒購自Promega公司。IPTG購自天根(北京)公司，HisTrapTMFF蛋白純化柱購自GE公司，限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ和T4 DNA ligase連接酶均購自NEB公司，其他試劑均為國產分析純。

1.2 PCR擴增引物的設計與合成

根據NCBI已公布的黃牛BNBD5基因序列(登錄號：AJ278799)，利用Primer 5設計1對引物P1/P2。上游引物P1:5′-CGGGATCCGGATTTACTCAAGTAGTAAGAAATC-3′，下游引物P2：5′-CCCTCGAGTTACCACCTCCTGCAGCAT-3′，分別在上、下游引物5′端添加BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點(劃線部分)，并在其前端添加保護性堿基。引物由Invitrogen(上海)公司合成。

1.3 BNBD5基因的克隆與序列分析

取牦牛肺組織100 mg，加入1 mL Trizol液氮研磨提取總RNA，按照Promega試劑盒反轉錄獲得cDNA。以牦牛肺組織的cDNA為模板，PCR擴增BNBD5基因，擴增體系為:ExTaq12.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板(1 500 ng/μL)1 μL，雙蒸水補足25 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，35個循環；最后72 ℃再延伸5 min。取6 μL擴增產物在15 g/L瓊脂糖凝膠中進行初步電泳鑒定。膠回收產物與pMD19-T載體連接，經PCR鑒定后，將陽性重組質粒pMD19-BNBD5送Invitrogen(上海)公司進行測序。用MEGA5.0軟件將牦牛BNBD5基因序列與其他動物β-防御素5的mRNA序列進行比較，構建系統進化樹。

1.4 BNBD5基因原核表達載體的構建

將重組質粒pMD19-BNBD5與原核表達載體pET-32a(+)分別用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，將牦牛BNBD5基因亞克隆到原核表達載體pET-32a(+)上，構建重組表達載體pET32-BNBD5，用其轉化DH5α，挑選克隆進行菌液PCR鑒定，并提取重組表達載體進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，將陽性質粒送Invitrogen (上海)公司測序。

1.5 重組牦牛BNBD5蛋白的誘導表達

將陽性重組質粒pET32-BNBD5轉化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取單個菌落接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素(Amp)的5 mL LB 培養基中，37 ℃、200 r/min過夜培養，次日取培養物按照1∶100(體積比)的比例接種于50 mL含有Amp(100 μg/mL)的LB培養基中，于37 ℃、200 r/min 進一步擴大培養。當菌液OD600=0.6時，加入0.5 mmol/L的IPTG誘導表達，于誘導不同時間(0，1，2，3，4，5，6 h)各取2 mL菌樣，8 000 r/min離心5 min，收集沉淀，加入50 μL PBS (pH=7.4)和50 μL 2×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸10 min，然后進行SDS-PAGE電泳(5%的濃縮膠，15%的分離膠)。

1.6 重組牦牛BNBD5蛋白的純化

取10 mL含目的蛋白的菌液接種到1 L LB培養基中，37 ℃、200 r/min振蕩6 h，4 ℃、8 000 r/min 離心10 min收集菌體，加入磷酸鹽緩沖液重懸，超聲破碎(200 W，超聲6 s，停9 s，直到樣品澄清)后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，分別收集上清和沉淀。沉淀用體積分數1%Triton和2 mol/L的尿素各洗2次，4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集沉淀，然后用8 mol/L尿素溶解沉淀(1 g濕質量加入10 mL尿素)，4 ℃過夜，12 000 r/min離心20 min，收集上清用0.45 μm濾膜過濾，然后用HisTrapTMFF純化柱純化蛋白，并對純化蛋白進行SDS-PAGE分析。將純化后的蛋白放入透析袋，然后將透析袋依次放入含6，4，2，1 mol/L尿素的復性液中于4 ℃各透析2 h，最后將透析袋置于不含尿素的磷酸鹽緩沖液中4 ℃透析過夜，使蛋白質在此過程中復性。

1.7 重組牦牛BNBD5蛋白體外抑菌活性的檢測

參照文獻[11-12]的Bradford 法檢測純化的重組蛋白的濃度。根據前人對牛防御素的最小抑菌試驗[11-12]，采用瓊脂擴散法，分別取對數生長期的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌(各5×106CFU) 涂LB平板，將經高壓滅菌過的濾紙片蘸取0.08和0.10 mg/mL 純化后的重組蛋白溶液，置于倒好的無抗生素的LB固體平板上，同時設氨芐青霉素為陽性對照，純化的pET-32a(+)空載蛋白為陰性對照，于37 ℃培養過夜，觀測以濾紙片為中心的抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 牦牛β-防御素5基因的克隆與序列分析

本研究根據GenBank 上提交的黃牛BNBD5的基因序列，利用RT-PCR從牦牛肺組織中擴增得到約138 bp 的牦牛BNBD5基因片段(圖1)，與目的基因片段長度相符，編碼45個氨基酸殘基(圖2)，并且含有防御素的特征性分子結構，即在特定位置上有6個保守的半胱氨酸殘基，分別在分子內形成Cys1-Cys5、Cys2-Cys4 和Cys3-Cys6共3對二硫鍵。同源性分析表明，牦牛BNBD5基因與黃牛BNBD5同源性最高，達86.2%，與其他物種BNBD5的同源性為21.0%～79.7%(表1)。牦牛BNBD5基因的系統進化分析結果見圖3。

圖1 牦牛β-防御素5基因的PCR擴增

2.2 牦牛BNBD5基因原核表達載體的構建

重組質粒pET32-BNBD5 經PCR檢測，獲得了138 bp的目的片段，BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后也得到138 bp的片段(圖4)，證明外源基因片段已成功插入到質粒中。

圖2 牦牛BNBD5基因序列及其編碼的氨基酸序列下劃線標示保守的半胱氨酸

表1 β-防御素5基因核酸序列的同源性比較

圖3 牦牛與其他物種BNBD5基因的系統進化樹

2.3 牦牛BNBD5重組蛋白的表達及純化

SDS-PAGE電泳結果(圖5)表明，與誘導前的菌體相比，誘導后的菌體有1條明顯的特異性條帶，與預期大小25 ku相符合，誘導后，表達量明顯增加。BNBD5重組蛋白主要以包涵體的形式存在，上清中蛋白因濃度太低幾乎檢測不到，BNBD5蛋白經親和層析純化后可得到比較純的融合蛋白(圖6)。

2.4 pET32-BNBD5融合蛋白的抑菌活性

將純化后的BNBD5基因成熟肽融合蛋白進行體外抑菌試驗，結果(圖7)顯示，BNBD5基因成熟肽融合蛋白對革蘭氏陰性菌(E.coil)具有較強的抑菌活性。當其質量濃度為0.08 mg/mL時，抑菌圈直徑為7.21 mm；當其質量濃度達到0.10 mg/mL時，可看到明顯的抑菌效果，抑菌圈直徑為7.62 mm；但抑菌圈都小于氨芐青霉素(13.5 mm)，而純化的空載蛋白無抑菌圈。BNBD5基因成熟肽融合蛋白對革蘭氏陽性菌(S.aureus)也有較強的抑菌活性。當其質量濃度為0.08 mg/mL時可以觀察到抑菌圈，抑菌圈直徑為5.61 mm；當其質量濃度為 0.10 mg/mL 時抑菌效果較明顯，抑菌圈直徑為 6.73 mm；但氨芐青霉素的抑菌圈(12.7 mm)更大，純化的空載蛋白亦無抑菌圈。

圖4 重組質粒pET32-BNBD5的BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切分析

圖5 牦牛BNBD5融合蛋白表達的SDS-PAGE分析

圖6 融合蛋白BNBD5表達形式的鑒定及純化蛋白的SDS-PAGE

圖7 重組牦牛BNBD5蛋白抑菌活性的檢測

3 討 論

防御素是一種具有代表性的內源抗菌肽，其廣泛表達于哺乳動物的組織細胞中。大量研究表明，無論是重組表達還是人工合成的防御素，對細菌、真菌，甚至一些被膜病毒[13]都有很強的殺傷力，且無毒副作用，不會使病原微生物產生耐藥性[14-16]。但動物體內天然防御素較少，分離成本較高，使得防御素的利用受到限制，因此通過基因工程手段在體外獲得3～5 ku的防御素分子[17-19]，可在一定程度上擴大其利用范圍，但如何提高表達水平及表達產物的穩定性，使合成的防御素有更好的殺菌活力及更廣譜的殺菌效果還需深入研究。

本研究根據已發表的黃牛BNBD5(AJ278799)基因序列，設計特異性引物，利用RT-PCR方法從牦牛肺組織中克隆了牦牛BNBD5基因成熟肽編碼區。經測序分析，該成熟肽編碼區大小為138 bp，編碼45個氨基酸殘基，內含6個位置保守的半胱氨酸殘基，分別在分子內形成Cys1-Cys5、Cys2-Cys4 和Cys3-Cys6 3對二硫鍵，這是β-防御素的基本結構單元[20-21]。將該基因成熟肽序列與其他物種的BNBD5成熟肽序列進行同源性分析發現，該基因與黃牛BNBD5的同源性最高，可達86.2%。從遺傳進化樹可知，哺乳類動物和禽類都存在β-防御素，但他們的同源性都比較低。針對這一現象，很多學者用達爾文進化論來解釋[22-23]，認為不同物種感染的病原體有可能不同，為了抵御外源病原體，一些基因就會發生有利于自身的突變，從而導致防御素在物種間的同源性較低。

大腸桿菌原核表達系統是目前常用的表達系統之一，以其表達的融合蛋白多以包涵體的形式存在，這樣既能保護目的蛋白不被蛋白酶降解，又能提高重組蛋白的產量及穩定性，且不會影響目標蛋白的功能及活性[24-25]。本試驗采用His組氨酸標簽融合表達系統進行牦牛BNBD5的原核表達，用GE公司的HisTrapTMFF純化柱純化蛋白，在包涵體的溶解、復性及透析過程中加入2 mmol的β-巰基乙醇有助于二硫鍵的正確折疊，從而使純化的目的蛋白有活性。防御素的抗菌機理非常復雜，他們對微生物作用的活性與特異性主要取決于他們的理化性質，例如陽離子凈電荷和疏水性質、β-防御素結構、低聚反應、蛋白水解穩定性等。目前對于防御素的抗菌機制并沒有統一的說法，普遍被大家接受的說法是胞膜攻擊作用，即抗菌肽作用于細菌的細胞膜，破壞膜的完整性使離子通透性失衡，細胞內容物大量滲出而導致細胞死亡[26]。本研究制備的重組牦牛BNBD5融合蛋白對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌都具有抑菌活性；空載體純化的蛋白不具有抑菌活性，不影響重組蛋白的活性，這與前人的研究結果[27-28]一致。但由于本試驗都只選了1種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌進行抑菌活性研究，因此不能說明純化的重組蛋白對其他細菌的抑菌活性，這是本研究的不足之處。

本試驗克隆的牦牛BNBD5成熟肽在BL21中得到了高效表達，且純化的蛋白對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有很強的抗性，可為防御素代替抗生素成為新型的抗菌藥物提供理論依據，但有關牦牛防御素的抗菌作用機制等還有待進一步研究。

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