利用熱帶假絲酵母發酵生產長鏈二元酸的研究進展

桂秋芬,姚嘉旻,蔣洋松,趙意平

(淮安清江石油化工有限責任公司，江蘇 淮安 223002)

長鏈二元酸(DCA)是指碳鏈上含有10個以上碳原子的脂肪族二元酸，是制造高級香料、高性能尼龍工程塑料、高檔尼龍熱熔膠、高溫電解質、高級潤滑劑、高級油漆和涂料、耐寒性增塑劑、樹脂、醫藥和農藥的重要原料[1-2]。長鏈二元酸不能從自然界直接獲取，多采用植物油裂解法或化學合成法制取，這兩種制備方法都存在很多弊端。20世紀70年代起，微生物發酵法以原料來源廣、反應專一性強、反應條件溫和等優勢已成為綠色化學生物合成中一個重要的研究開發領域[3-5]。

長鏈二元酸發酵技術工業化應用始于20世紀末、本世紀初，我國和日本在此領域開展了大量工作。從1998年開始，我國在江蘇、山東、遼寧等地先后建立了6家生產企業[6]。長鏈二元酸發酵技術工業化應用方面的研究主要集中在以下3個方面:(1)長鏈二元酸產酸優勢菌株的選育；(2)培養基組成的優化和發酵工藝條件的調控；(3)長鏈二元酸后續提純工藝的選取與優化。作者在此對這三方面的研究進展進行了綜述，并提出了有待進一步研究的問題。

1 產酸優勢菌株的選育

1.1 生產菌株來源

目前，國內二元酸生產企業工業化菌株主要來源于中國科學院微生物研究所、中國科學院上海植物生理生態研究所、中國石化撫順石化研究院，這3家科研機構針對不同來源熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)菌已進行了數十年之久的艱辛研究工作。

1)中國科學院微生物所 20世紀70年代起，中國科學院微生物所在方心芳院士等的帶領下，開始從事微生物發酵生產長鏈二元酸的基礎理論研究和微生物發酵正構烷烴生產長鏈二元酸的應用開發研究，目前發酵工業放大技術已成熟。據CN1928100A 報道利用CH-14-204菌株在50 m3發酵罐中發酵130 h，十二碳二元酸(DCA12)產酸量達145 g·L-1[7]。

2)中國科學院上海植物生理生態研究所 20世紀70年代起，該所開展微生物發酵正十五烷烴生產十五碳二元酸(DCA15)的基礎理論和應用研究，發酵產酸水平接近72.5 g·L-1[8]，與中國科學院微生物所[3]水平相當。

3)中國石化撫順石化研究院 1987年，中國石化撫順石化研究院從中國科學院上海植物生理生態研究所購取熱帶假絲酵母菌株，開展微生物發酵制備DCA12、十三碳二元酸(DCA13)的應用開發研究。其中熱帶假絲酵母突變株SP2UV256已用于工業化發酵生產DCA13，培養6 d 的平均產酸量為156.5 g·L-1，而DCA12在10 L發酵罐中培養6 d 的平均產酸量為170 g·L-1，但工業化應用報道較少[9]。

1.2 優勢菌株的選育進展

1.2.1 熱帶假絲酵母代謝烷烴的途徑[10-12](圖1)

由圖1可以看出，熱帶假絲酵母代謝烷烴的途徑可分為5個步驟：(1)酵母細胞吸收烷烴并轉運至細胞內；(2)烷烴被P450酶系α-氧化成DCA12；(3)十二碳一元酸進一步被相同酶系ω-氧化成DCA12；(4)十二碳一元酸或DCA12被β-氧化成二氧化碳和水；(5)酵母細胞利用H+濃度梯度轉運DCA12，分泌至酵母細胞外。其中，步驟(2)、(3)是慢速反應過程，步驟(5)是快速反應過程。

圖1 熱帶假絲酵母烷烴代謝和糖代謝的途徑Fig.1 The metabolic pathway of paraffin and sugar for Candida tropicalis

結合代謝烷烴和碳水化合物消耗的途徑，高產熱帶假絲酵母菌株要求：(1)菌株的α，ω-氧化能力強，在蔗糖碳源中生長良好，產酸水平高；(2)菌株的β-氧化能力相對較弱，難以利用烷烴或同化烷烴生長，對產物DCA12降解能力差。

1.2.2 產酸優勢菌株選育研究進展

誘變育種是基于基因突變的菌種改良方法,其理論基礎是改變遺傳物質DNA的結構,從而使得傳代菌種在遺傳性狀上發生突變。20世紀90年代起，隨著基因工程技術、離子束生物技術的發展，構建β-氧化阻斷型菌株、低能離子束注入新興技術手段在菌種改造方面得以應用[13]。

1)理化因素誘變

目前，應用比較成功和常用的誘變方法有：(1)紫外線照射處理誘變。紫外誘變技術早在20世紀70年代即得到應用，日本礦業公司利用紫外誘變等手段篩選出熱帶假絲酵母菌變異株M2030，發酵120 h可產酸130 g·L-1[14]；趙興青[15]在篩選產DCA13菌株過程中采用蔗糖(唯一)碳源培養基、烷烴(唯一)碳源培養基、苯酚紅顯色培養基復合篩選假絲酵母菌株，并通過紫外誘變方法進一步提高優勢菌株的產酸性能，取得了比較理想的搖瓶產酸效果；(2)亞硝酸鈉處理誘變。陳遠童等[16]在篩選Δ9-1,18-十八烯二元酸生產菌株過程中采用NaNO2誘變，也取得了比較好的產酸量；(3)亞硝基胍處理誘變。CN 1928100A[7]報道采用亞硝基胍作為化學誘變劑，篩選出高產假絲酵母菌CH-14-204，發酵139 h時產酸量為192.3 g·L-1；(4)多倍體誘變育種。沈永強等[17]用秋水仙堿和樟腦分別誘變菌株N-26產生多倍體細胞NPCO2和NPca18，其產生DCA15能力從出發菌株的10 g·L-1分別提高到17.3 g·L-1和18.3 g·L-1[17-18]；(5)復合誘變育種。CN95117436.3報道了一株高產長鏈二元酸的假絲酵母菌的篩選方法，先用硫酸二乙酯誘變假絲酵母菌，再利用紫外線二次誘變酵母細胞及氯丙嗪濃縮α,ω-氧化增強的假絲酵母菌，發酵130 h時產酸量為145 g·L-1，轉化率為90%[19]。

2)利用基因工程技術改造菌種

隨著分子生物學的進一步發展，基因工程技術也被用于構建長鏈二元酸生產菌株。美國Picataggio等用基因工程方法構建β-氧化阻斷型菌株H5343,在小型發酵罐中發酵n-C12生產DCA12,產酸水平從 95 g·L-1提高到140 g·L-1[5,20]。高弘等[20]構建了肉毒堿?；D移酶基因單拷貝缺失菌和雙拷貝缺失菌，并對基因重組菌的生長及產酸特性進行研究，發現肉毒堿?；D移酶基因雙拷貝缺失菌不能夠代謝烷烴。

基因工程菌易于退化，并存在某些問題，暫無工業化方法相關報道。

3)N+離子束注入誘變育種

陳祖華等[21]以熱帶假絲酵母SCB412作為出發菌株，經能量為50 keV、劑量為1×1011～5×1015ion·cm-2的N+離子束注入誘變處理篩選獲得一株能夠利用n-C12生產DCA12的高產菌株，產酸量從43.5 g·L-1上升到73.2 g·L-1；楊艷裴[22]經2次N+離子束注入對熱帶假絲酵母菌進行誘變，篩選到高產突變株，產酸量由29.77 g·L-1提高到73 g·L-1；CN 1928100A[7]報道通過硝基胍、亞硝酸、紫外線和N+離子束注入等多種誘變方法，篩選出高產假絲酵母菌CH-14-204，發酵139 h時產酸量為192.3 g·L-1，轉化率為88.8%。

1.3 國內生產企業在菌株選育方面的進展

隨著我國發酵法生產長鏈二元酸技術的突破，我國長鏈二元酸的產能已躍居世界第一。自1998年開始，借助中國科學院微生物所、中國科學院上海植物生理生態研究所、中國石化撫順石化研究院3家科研機構的技術支持，我國在江蘇、山東、遼寧等地先后建立了6家生產企業[6]。CN 02145431.0[23]報道，凱賽生物公司于2002年誘變選育出一株熱帶假絲酵母突變菌株(CCTCCM 202042)，利用n-C14為底物發酵可獲得190 g·L-1十四碳二元酸(DCA14)；CN 1570124A[24]報道，凱賽生物公司誘變選育熱帶假絲酵母菌(CCTCC No.203052)，于2004年申報以C9～C18烷烴或脂肪酸為底物發酵生產正長鏈二元酸的方法；CN 1844404A[25]報道，南通圣諾鑫公司于2006年申報微生物發酵生產混合長鏈二元酸的方法；2009年山東瀚霖生物依托中國科學院微生物所發酵技術快速發展起來，并于2010年陸續申報CN 102010318A 、CN 201686632U、CN 101955424A等6項中國專利，主要涉及長鏈二元酸生物發酵生產裝置[26-28]。

綜上所述，建立合適的誘變育種方法，篩選出烷烴轉化率高、發酵周期短、產酸性能強、性能穩定的優良菌株，可有效降低長鏈二元酸生產成本，增強該類項目的競爭力與抗風險能力。

2 發酵工藝的優化

2.1 發酵模型

長鏈二元酸發酵過程屬非生長偶聯型發酵(Gaden-Ⅲ型發酵)[29]，即酵母菌增殖與二元酸產物積累之間無關聯，菌體增殖與產物代謝分兩步進行(圖2)：發酵前期，菌體大量繁殖，以其生長為主，pH值控制在3～5；發酵后期，菌體數量達到一定值后以菌體發酵產酸為主，pH值控制在6.5～7.5最佳[30]。

圖2 長鏈二元酸發酵曲線Fig.2 The fermentation curves of long chain dicarboxylic acid

2.2 發酵工藝優化進展

2.2.1 培養基組分優化

長鏈二元酸發酵培養基需要碳源、氮源、生長必需的無機鹽及微量生長因子等。劉祖同等[31]研究表明，利用熱帶假絲酵母生產長鏈二元酸，尿素是最好的氮源；但沈永強等[32]研究發現，當尿素量過高時，不積累長鏈二元酸。除碳源、氮源外，種子培養基中還要有生長必需的無機物及微量生長因子，如磷酸鹽、氯化鈉、硫酸鎂、維生素、玉米漿以及酵母膏等。沈永強等[32]和許曉增等[14]還發現，磷酸二氫鈉含量為0.1%～0.2%、磷酸氫二鉀含量為0.4%～0.6%時利于長鏈二元酸積累；Mobley等[33]指出，酵母膏對增加酸產量必不可少，其最適量為0.05%～0.10%，超過此限度產酸量減少，鎂離子最小量為0.05%，如果鎂離子缺乏，酸產量下降約75%。

2.2.2 代謝途徑及相關酶系調控

獲得優良生產菌株后，對發酵過程進行必要的代謝調控十分重要。經誘變選育出來的高產菌株，其ω-氧化能力增強、β-氧化能力削弱，但β-氧化并沒有完全被阻斷(圖1)。因此，在發酵過程中必須進一步降低β-氧化酶活力、增強ω-氧化酶活力。

1)ω-氧化酶系調控

熱帶假絲酵母菌在烷烴代謝過程中的α，ω-氧化過程主要由細胞色素P450酶系(CYP)、醇氧化酶(FAO)和醛脫氫酶(FALDH)等催化完成，反應在細胞內的微粒體中發生[34]。

CYP是ω-氧化過程中的關鍵酶和限速酶，CYP酶活力的提高必然會提高細胞的產酸能力，例如：(1)在種子培養基中(或發酵的生長階段)加入烷烴可以誘導CYP酶活的提高。Bertrand等[35]發現CYP在以烷烴為底物時含量比以葡萄糖為底物時高出20倍。高濃度的烷烴條件下，雖然烷烴本身并不利于細胞的生長，但是卻促進了CYP的表達[35-36]；(2)在烷烴代謝過程中添加Fe3+可以提高CYP酶活力[35]；(3)青霉素的添加可改善細胞膜的滲透性，有助于ω-氧化能力增強[37]；(4)苯巴比妥是CYP的誘導劑，苯巴比妥類誘導劑可與CYP基因的阻礙蛋白結合[38]。王麗菊[39]在發酵12 h時添加0.5 g·L-1苯巴比妥能增強ω-氧化能力，但過量添加則會產生抑制作用；(5)過氧化氫酶體增殖劑 (PPARs)對CYP也有誘導作用。1996年，Ohtomo等[40]報道了過氧化氫增殖因子對低等真核生物麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)CYP的誘導作用；張劍等[41]指出H2O2能明顯提高產酸和CYP酶活，還可以提高ω-氧化酶活力。

2)β-氧化酶系調控

熱帶假絲酵母降解長鏈二元酸的β-氧化酶系包括?；o酶A氧化酶(ACO)、烯酰輔酶A水合酶、3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶、3-酮脂酰輔酶A硫解酶和乙酰輔酶A硫解酶，脂肪酸的β-氧化是降低烷烴轉化率的主要因素。相關的酶還包括?；o酶A合成酶、肉毒堿脂酰轉移酶等[42]。

在熱帶假絲酵母中，ACO是長鏈二元酸降解的限速酶，而β-氧化在過氧化物酶體中進行。脂肪酸β-氧化中間產酸[脂酰輔酶A，即HOOC-(CH2)n～SCOA]的轉運是β-氧化中的重要環節，這一環節中起關鍵作用的是肉毒堿脂酰轉移酶。研究表明，β-氧化酶系的調控方式主要有：(1)添加ACO抑制劑。丙烯酸是ACO的反競爭性抑制劑，添加量為0.05%～0.10%時有明顯促進作用，但用量超過0.2%時，反而不利于二元酸的積累[38]；維生素C是ACO的競爭性抑制劑，有強烈的抑制作用[43]，但維生素C具有酸性和較強的還原性，不利于長鏈二元酸的分泌；(2)添加金屬離子Ag+和Pb2+完全抑制ACO活性，添加Ba2+、Ca2+和Mg2+有明顯抑制作用；(3)添加非離子型表面活性劑對ACO有不同程度的抑制作用[43]；(4)利用基因工程技術阻斷β-氧化途徑。1998年，Picataggio等用基因工程方法，構建β-氧化阻斷型菌株H5343,在小型發酵罐中發酵n-C12生產DCA12,產酸水平從95 g·L-1提高到140 g·L-1[5,18]；2001年，Hara等[44]構建熱帶假絲酵母M1210A3，指出ACO的表達與長鏈二元酸產量沒有必然聯系，而?；o酶A合成酶表達量降低時，長鏈二元酸產量提高。

3)小分子效應物調控

近年來，人們又發現在培養基中加入產酸促進因子會提高產酸量。丙氨酸作為小分子有機酸，對微生物的TCA循環、過氧化氫酶活力和谷氨酸脫氫酶活力有影響，當其加入量為0.5%時，明顯促進DCA12的產生[45]；在雙底物發酵中加入醋酸鈉，可以提高DCA13產量和烴酸轉化率，原因可能是醋酸衍生物進入烷烴β-氧化的同化過程，提供細胞代謝所需要的碳源和能量，從而降低了產物DCA的降解，同時參與ω-氧化酶系的活性調節，促進DCA合成[46]。

2.2.3 發酵工藝調控

根據熱帶假絲酵母合成長鏈二元酸發酵體系的特點，發酵工藝中pH值、溶解氧、補料及轉發酵時間對發酵影響較大。

1)pH值控制

生產長鏈二元酸的熱帶假絲酵母，其菌體生長和產酸的最適pH值不相同，菌體生長的最適pH值為5.0左右，而產酸的最適pH值在7.8±0.2[15]。pH值對細胞分泌長鏈二元酸以及長鏈二元酸的溶解性影響較大，pH值過低或過高都不利于長鏈二元酸的分泌，pH值過高時抑制菌體活性，中性偏堿的環境利于ω-氧化、抑制β-氧化，但在產酸發酵末期，常利用提高pH值方式促進殘烴充分利用[14,47]。發酵過程中控制合理的pH值范圍，既有利于難溶于水的長鏈二元酸轉變成易溶于水的長鏈二元酸鹽，又有利于抑制β-氧化，從而提高產酸速率和長鏈二元酸的純度。

2)溶解氧控制

發酵液中溶解氧大小受通氣量、罐壓、攪拌速度的影響，且三種因素對溶解氧的影響大小為：攪拌速度>罐壓>通氣量。溶解氧不是越高越好，劉樹臣等[46，48]發現在DCA13發酵中加強攪拌混合效果和控制低溶解氧是穩定提高長鏈二元酸產量的有效方法，在DCA12發酵中控制溶解氧水平在20%～30%最適于產酸，過高的溶解氧水平對提高產酸水平作用不明顯，反而增加能耗。

3)補料控制

對于發酵法生產長鏈二元酸的補料控制，文獻報道主要集中于雙底物正構烷烴和蔗糖。其中，起始烷烴濃度、分批補加烷烴的加入量和時間與產酸的關系密切。劉祖同等[31]以DCA13為例，起始烷烴濃度為15%、每隔48 h補加10%基質的產酸量比起始烷烴濃度為8%、每隔24 h流加5%基質的產酸量提高22%。趙興青[15]在菌體進入產酸期24 h、48 h、72 h時分別補加0.5%的蔗糖繼續發酵，48 h加0.5%蔗糖時產酸量提高效果最好，但補加烷烴和蔗糖都會延長發酵時間。

4)轉發酵時間控制

轉發酵時間的控制決定了發酵過程的產酸水平。佟明友等[49]在DCA13發酵中在線檢測參數DO、尾氣中O2含量和CO2含量與菌體濃度的變化規律，發現當DO曲線降至低谷時，表明菌體的對數生長期即將結束，此時可以調節工藝條件轉入產酸階段。

3 提純工藝研究

3.1 發酵液預處理

發酵液是一個復雜的多相體系，其中含有未反應的烷烴、酵母碎片、殘留培養基、代謝產物以及微生物的分泌物等[50]。發酵終止后，將發酵液加熱、破乳，經微濾膜過濾去除殘留烷烴層、乳化層、菌體層，可獲得澄清透亮的發酵清液即長鏈二元酸粗品，但存在單酸純度偏低、總氮和鐵離子含量偏高等問題，仍需進一步提純精制。

3.2 提純工藝進展

長鏈二元酸提純工藝主要有水相提純法、酯化提純法、醇溶結晶法、鹽析結晶法、溶劑精制法等。

1)水相提純法

水相提純法是用活性炭或超濾膜脫除發酵清液中部分色素、蛋白質及有機雜質等，再用濃H2SO4酸化結晶，冷卻、過濾，得到長鏈二元酸結晶，但純度<97.5%，色素含量仍比較高[14]。該法具有投資少、操作簡單、安全環保等優點，但產品純度低、色澤差、晶體粒度不均勻、蛋白質及其它雜質含量高。要想獲得高質量產品，需進一步改進母液除雜與結晶控制的方法。

2)酯化提純法

酯化提純法對原料純度要求不高，是將長鏈二元酸粗品與低碳醇進行酯化反應、皂化水解、酸析結晶進行精制，長鏈二元酸純度可達99%以上。但該法存在醇加入量過高、反應時間長、能耗高等缺點，不適宜大規模工業化生產，還需要進一步加以研究改進[51]。

3)醇溶結晶法

醇溶結晶法是將發酵液經膜過濾除去菌體，活性炭脫色、酸化結晶、過濾，得到的濕濾餅溶解于加熱的C2～C5醇類(如乙醇、辛醇、C2～C5二元醇等)中，再經活性炭脫色過濾，冷卻，結晶，得到長鏈二元酸純品。因常溫下醇類對長鏈二元酸溶解性比較高，該法存在溶液損失率>15%、產品損失率約10%、產品中殘留少量酯化物雜質、結晶顆粒細小等問題[52-53]。

4) 鹽析結晶法

鹽析結晶法是將發酵清液在堿性條件下加熱，加入鹽析劑，冷卻，將析出的長鏈二元酸鹽晶體再溶于熱水中，經酸化結晶、分離干燥，得精制長鏈二元酸。該法存在酸損失較大、鹽析劑投入量高、產品純度可控性差等問題[18,53]。

5) 溶劑精制法

溶劑精制法是將發酵液經膜過濾除去菌體、活性炭脫色、酸化結晶、過濾得到的長鏈二元酸粗品溶解于醋酸[24]、丙酮[53]、甲基異丁基酮[54]等與其不產生化學反應的有機溶劑中，再經活性炭脫色、抽濾，濾液冷卻結晶，得白色長鏈二元酸結晶。該法具有產品純度高、色澤好、結晶顆粒大的優點，可滿足聚合級產品質量的要求，但存在投資大、成本高、污染環境等問題。

4 結語

綜上所述，現階段長鏈二元酸生產菌的篩選仍主要通過傳統的誘變篩選方法尋找優勢菌株，其效率低、工作量大，隨著新興基因工程技術的發展，如何利用基因工程技術高效篩選性能穩定的高產菌株將是后續研究的重點。選擇高效的β-氧化抑制劑和ω-氧化促進劑，以及通過發酵條件與設備的優化進一步提高生產效率是發酵工藝優化的主要方向?，F有長鏈二元酸提純工藝方法各有優缺點，如何組合它們的優點建立易于操作、投入少、環保、產品純度高的提純工藝路線，也是需要進一步研究的課題。

[1] 任剛，陳遠童.十二碳二元酸的發酵研究[J].生物工程學報,2000,16(2):198-202.

[2] Picataggio S,Rohrer T,Deanda K,et al.Metabolic engineering ofCandidatropicalisfor the production of long-chain dicarboxylic acids[J].Nature Biotechnology,1992,10(8):894-898.

[3] 陳遠童，郝秀珍.熱帶假絲酵母的β-氧化及代謝控制研究[J].生物工程學報,1987,3(4):307-308.

[4] 陳遠童，郝秀珍.微生物發酵生產十一烷-1,11-二羧酸的研究[J].生物工程學報,1989,5(3):241-245.

[5] 陳遠童，郝秀珍，龐月川.十五碳二元酸的發酵研究[J].微生物學通報,1995,35(6):433-437.

[6] 陳遠童.十二碳二元酸工業生產試驗研究[J].微生物學通報,1998,25(4):244.

[7] 陳遠童，郝秀珍，徐軍.生物合成生產十二碳二元酸的新方法：中國，1928100A[P].2007-03-14.

[8] 沈永強，樓純菊，徐可仁，等.石油發酵長鏈二元酸的研究Ⅲ.熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)多倍體變種生產十三烷1∶13二羧酸的發酵條件研究[J].植物生理學報,1979,5(4):385-393.

[9] 劉樹臣，李淑蘭，楊東.十三碳二元酸發酵工業試驗[J].石油化工,2002,31(7):558-561.

[10] 許曉增，佟明友，李家鵬.長鏈十三碳二元酸發酵過程的動力學分析與模型初探[J].石油煉制與化工，1994,25(1):15-18.

[11] 張志禹，朱濤，林榮勝，等.熱帶假絲酵母的二元酸分泌現象及其動力學[J].清華大學學報 (自然科學版)，1999,39(12):27-30.

[12] 張志禹，朱濤，林榮勝，等.產長鏈二元酸熱帶假絲酵母酸分泌過程研究[J].微生物學雜志，1998,18(4):17-20.

[13] 陳遠童.生產長鏈二元酸菌株的誘變篩選[J].微生物學通報,2001,28(2):104.

[14] 許曉增，佟明友.長鏈二元酸發酵技術[J].現代化工，1996，16(1)：22-24.

[15] 趙興青.發酵法生產十三碳二元酸的試驗研究[D].沈陽：東北大學,2003.

[16] 陳遠童，龐月川，郝秀珍.△9-1,18-十八烯二元酸生產菌株的篩選和誘變[J].微生物學報，1997,37(1):65-67.

[17] 沈永強，樓純菊.石油發酵長鏈二元酸的研究[J].植物生理學報，1979,5(4):385-393.

[18] 唐如星.發酵法生產十三碳二元酸的初步研究[D].天津：天津科技大學,2001.

[19] 陳遠童，郝秀珍，方心芳.微生物同步發酵生產長鏈α,ω-二羧酸的方法:中國，95117436.3[P].1996-09-01.

[20] 高弘，李春，華玉濤，等.長鏈二元酸代謝中肉毒堿脂酰轉移酶的作用[J].中國生物工程雜志，2003，23(6)：14-16．

[21] 陳祖華，葉晴，尹光琳.N+離子注入熱帶假絲酵母對長鏈二元酸的影響[J].微生物學通報，2000,27(3):174-177.

[22] 楊艷斐．離子注入在發酵工業中的應用及研究N+離子注入熱帶假絲酵母菌對其十三碳二元酸產量的影響[D].天津:天津師范大學,2001．

[23] 陳遠童，衷金生，劉文鳳.一種利用微生物發酵高產α，ω-正長鏈十四碳二元酸的方法：中國，02145431.0[P].2004-04-09.

[24] 邱勇雋，李乃強，胡兵.一種正長鏈二元酸的生產方法：中國，1570124A[P].2005-01-26.

[25] 張肅靜，陳遠童.微生物發酵生產混合長鏈二元酸的方法：中國，1844404A[P].2006-10-11.

[26] 王志洲，曹務波，陳遠童.一種混合長碳鏈二元酸的生產方法：中國，102010318A[P].2011-04-13.

[27] 王志洲，曹務波，陳遠童.生物發酵法生產長碳鏈二元酸的精制生產裝置：中國，201686632U[P].2010-12-29.

[28] 王志洲，曹務波，陳遠童.長碳鏈二元酸精制生產過程溶劑回收裝置：中國，101955424A[P].2011-01-26.

[29] 山根恒夫.生物反應工程[M].上海:上?？萍汲霭嫔?1989.

[30] 加藤恒一，植村南海男．利用發酵法制造二元酸：日本，5611796A[P].1981-04-26.

[31] 劉祖同，高忠翔.微生物發酵法生產二羧酸[J].石油學報(石油加工)，1989，5(2)：8-12.

[32] 沈永強，夏國興，樓純菊，等.石油發酵長鏈二元酸的研究(Ⅳ).熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)休止細胞轉化正烷烴為相應長鏈二元酸的研究[J].植物生理學報,1980，6(1)：29-35.

[33] Mobley D P，Shank G K．Fermentation medium and method for producingα,ω-alkanedicarboxylic acids：美國，6004784[P].1999-12-21．

[34] Cheng Q，Sanglard D，Vanhanen S，et al．Candida yeast long cha-in fatty alcohol oxidase is a span class="emphasis_italic">c-type haemoprotein and plays all important role in long chain fatty acid metabolism[J]．Biochimica et Biophyrsica Acta，2005,1735(3)：192-203.

[35] Bertrand J C，Bazin H，Zacek M，et al．NADPH-Cytochromecreductase ofCandidatropicalisgrown on alkane[J]．Eur J Biochem,1979,93(2)：237-243．

[36] 焦鵬，華玉濤，李書良，等．熱帶假絲酵母轉化烷烴過程中P450酶活的研究[J]．微生物學報，2001，41(1)：117-120.

[37] 冷欣夫，邱星輝．細胞色素P450酶系的結構、功能和應用前景[M]．北京：科學出版社，2001：189-198．

[38] 陳遠童.微生物發酵生產長鏈二元酸的代謝調控[J].微生物學通報,2001,28(3):102.

[39] 王麗菊.發酵法生產十五碳二元酸[D].無錫:江南大學,2008．

[40] Ohtomo R，Kebayashi K，Muraoka S I，et al．Peroxisome proliferators activate cytochrome P450 genes in all alkane-assimilation yeast，Candidamaltosa[J]．Biochemical and Biophysical Research Communications，1996,222(3):790-793．

[41] 張劍，李春，高弘,等.H2O2對熱帶假絲酵母醇氧化酶的影響及其作用機理分析[J].中國生物工程雜志,2004,24(1):62-65.

[42] Kawamoto S,Nozaki C,Tanaka A,et al.Fatty acidβ-oxidation system in microbodies ofn-alkane-grownCandidatropicalis[J].Eur J Biochem,1978,83(2):609-613.

[43] 歐陽晶，榮東，郝秀珍，等.熱帶假絲酵母?；o酶A氧化酶的純化及性質研究[J].微生物學報,2002,42(6):713-719.

[44] Hara A，Ueda M，Matsui T，et al．Repression of fatty-acyl-CoA oxidase-encoding gene expression is not necessarily a determinant of high-level production of dicarboxylic acids in industrial dicarboxylic-acid-producingCandidatropicalis[J]．Appl Microbiol Biotechnol，2001,56(3-4)：478-485．

[45] Sacha F，Simone D，Carlo W T，et al．Identification of the peroxisomalβ-oxidation enzymes involved in the degradation of long-chain dicarboxylic acids[J]．Journal of Lipid Research，2004,45(6):1104-1111.

[46] 劉樹臣，李淑蘭，方向晨.十三碳二元羧酸發酵技術的研究[J].微生物學報,2000,40(3):318-321.

[47] Lin R,Cao Z,Zhu T,et al．Secretion in long-chain dicarboxylic acid fermentation[J].Bioprocess Engineering,2000,22(5)：391-396．

[48] 劉樹臣，李淑蘭，金平,等．十二碳二元酸發酵研究[J]．微生物學報，2002，42(6)：748-780．

[49] 佟明友，嚴益民，楊東,等．長鏈二元酸生產過程中菌體生長轉發酵時間的判斷[J]．石油煉制與化工，2001，32(8)：19-21．

[50] 李占朝.十二碳二元酸的精制工藝研究[D].北京：北京化工大學，2009.

[51] 解麗娟，張艷麗，王崇暉．十三碳二元酸的精制方法[J]．精細與專用化學品，2002，10(20)：13-14.

[52] 王崇暉，佟明友，宋喜軍.提取精制生物發酵液中長鏈二羧酸的方法：中國，135005A[P].2002-05-29.

[53] 劉其永，廖金玉，楊光耀.碳11～18長鏈二元酸精制方法：中國，1410408A[P].2003-04-16.

[54] 劉樹臣，彭永成，張建剛.一種精制長鏈二元酸的方法：中國，1219530A[P].1999-06-16.