益心舒膠囊對阿霉素致心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的影響

沈啟明，馬麗紅，王少霞，李 楊，張瑞華

心力衰竭（HF）是各種心臟疾患的終末狀態，也是心臟病患者死亡的主要原因。僅2008年在美國，HF的直接或間接治療費用大約為350億美元［1］。抑制心肌細胞凋亡能減輕心臟重構和衰竭的程度［2，3］。益心舒膠囊具有益氣復脈、活血化瘀、養陰生津的功效，臨床研究表明［4］，益心舒膠囊不僅能擴血管，改善心肌血液供應和心肌代謝的作用，而且還有增強心肌收縮力和改善左心功能的療效。為進一步探討其作用機制，本實驗擬通過對阿霉素（ADR）致HF大鼠模型進行藥物干預，探討益心舒膠囊對HF大鼠心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性SD大鼠48只，清潔級，體重（200±20）g，軍事醫學科學院動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK-（軍2007-004）。用隨機數表法將48只大鼠隨機分為4組：正常對照組、模型組、益心舒組及厄貝沙坦組，每組12只。

1.2 藥物及試劑 ADR：深圳萬樂藥業有限公司（產品批號：1103E2，10 mg／瓶）。益心舒膠囊：貴州信邦制藥股份有限公司提供（產品批號：20120107）。厄貝沙坦（irbesartan，Irb）：杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司（批號：1A255，規格：0.15 g）。原位末端轉移酶標記（TUNEL）試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；DAB顯色劑：北京中杉金橋生物技術有限公司生產；鼠抗Bcl-2 IgG及鼠抗Bax IgG：美國Santa Cruz公司生產。其他化學分析試劑均為分析純。

1.3 儀器設備 RM2135病理切片機（德國Leica）；CMIAS-Ⅱ圖像分析儀（北京航空航天大學圖像中心）；80-2電動離心機（金壇高科儀器廠）。

1.4 方法

1.4.1 模型建立 將注射用ADR用生理鹽水配成2 mg／m L溶液，參照周巖等［5］方法建立，36只造模大鼠均腹腔注射ADR 2.5 mg／kg，每周一次，持續6周，復制大鼠HF模型；另12只正常組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水。模型成功判定標準：病理學觀察，6周時造模各組隨機選取其中1只做病理檢測以確定模型是否成功。光學顯微鏡下觀察心肌組織。超聲心動圖檢查，于第6周末對模型組及正常對照組大鼠用水合氯醛麻醉后行超聲心動圖檢查，記錄大鼠左室舒張期末徑（LVEDD）、收縮期末徑（LVESD）、左室射血分數（LVEF）及左室短軸縮短率（FS），正常組與模型組有統計學意義。綜合病理學觀察和超聲心動圖檢查結果，判定模型取得了成功。

1.4.2 給藥 從大鼠注射ADR第6周開始灌胃給藥。益心舒組：將益心舒除去外層膠囊用蒸餾水配成混懸液，按人與大鼠體表面積折算為大鼠灌胃劑量，相當于臨床成人的正常劑量，為320 mg／（kg·d）；厄貝沙坦組劑量也折算為相應的成人正常劑量，為50 mg／（kg·d）；正常組和模型組大鼠予以與益心舒組等量生理鹽水，每天上午灌胃一次，連續給藥28 d。

1.4.3 指標檢測 末次給藥后禁食水12 h，以5%水合氯醛按4 ml／kg麻醉后稱重，取左室心肌部分綠豆大小組織浸泡于10%甲醛溶液中留待做病理檢查。光鏡下（10×20）進行病理學觀察。心肌細胞凋亡檢測。心肌細胞Bcl-2、Bax蛋白檢測，采用免疫組化法結合圖像分析半定量測定。

1.5 統計學處理 采用SPSS19.0軟件處理，計量資料以均數±標準差±s）表示，組間比較采用單因素方差分析法，兩兩比較采用LSD檢驗法。以P＜0.05差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況 造模過程中正常組大鼠毛色有光澤，行動敏捷，對周圍變化反應靈敏；其余組大鼠逐漸出現毛色枯槁、散亂豎起，脫毛，懶動，少食，腹瀉，口唇紫紺等癥狀體征，體重逐漸下降，第4周開始部分大鼠出現腹水和死亡，其中模型組死亡1只，益心舒組死亡1只，到第8周實驗結束時，正常組全部存活，模型組死亡3只，益心舒組死亡2只，厄貝沙坦組死亡2只。死亡大鼠解剖發現：腹水量較大，呈粉紅色渾濁樣，肝脾明顯增大，邊緣圓鈍，質地變硬，臟器粘連明顯；心臟增大，雙肺明顯淤血，其中1只有胸水。

2.2 病理學觀察 光學顯微鏡下觀察心肌組織，正常組心肌細胞形態正常，紋理清晰，無纖維增生；模型組可見心肌纖維改變，嗜酸性變性，壞死，間質纖維化等，程度上多為中度以下；益心舒組雖然可見心肌空泡變性和心肌纖維化等改變，但均為輕微改變。厄貝沙坦組心肌改變也主要表現心肌空泡變性和嗜酸性變性，個別動物空泡變性較重，與益心舒組無明顯差別。提示經益心舒治療后，大鼠心肌細胞損傷狀況得到明顯改善。

2.3 各組心肌細胞凋亡情況及凋亡率比較（見表1） 正常組大鼠心肌切片偶爾可見凋亡細胞；模型組大鼠心肌細胞凋亡嚴重，呈孤立、散在分布，棕褐色胞核數量明顯增多。與正常組相比，模型組的細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，益心舒組及厄貝沙坦組凋亡細胞數量明顯減少，凋亡率明顯下降（P＜0.01）；益心舒組與厄貝沙坦組比較無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠心肌細胞凋亡率±s） %

表1 各組大鼠心肌細胞凋亡率±s） %

組別 n 細胞總數 凋亡率正常組5 500 3.50±0.46模型組 5 500 17.12±1.991）益心舒組 5 500 11.41±2.052）厄貝沙坦組 5 500 10.54±2.072）與正常組比較，1）P＜0．01；與模型組比較，2）P＜0.01

2.4 各組Bcl-2、Bax表達水平及Bcl-2／Bax比較（見表2） 與正常組比較，模型組Bax蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達水平及Bcl-2／Bax顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，益心舒組及厄貝沙坦組Bcl-2蛋白表達水平均明顯升高，Bax蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.01）。

表2 各組大鼠Bax、Bcl-2蛋白表達及Bcl-2／Bax比較±s）

表2 各組大鼠Bax、Bcl-2蛋白表達及Bcl-2／Bax比較±s）

組別 Bcl-2（%） Bax（%） Bcl-2／Bax正常組 0.182±0.015 0.044±0.011 4.383±1.210模型組 0.072±0.0161） 0.188±0.0111） 0.383±0.0861）益心舒組 0.106±0.0152） 0.124±0.0112） 0.854±0.092厄貝沙坦組 0.110±0.0192） 0.102±0.0222） 1.121±0.325與正常組比較，1）P＜0．01；與模型組比較，2）P＜0.01

3 討 論

本實驗采用近年來比較成熟的ADR腹腔注射方法來制造大鼠HF模型，ADR是一種常用的抗腫瘤藥物，對心肌有著特殊的親和力，可引起類似擴張型心肌病樣改變以及在此基礎上發生的HF。其機制主要是通過心肌脂質過氧化損傷，抑制心肌肌漿網Ca2＋-ATP酶活性，并激活心肌局部腎素-血管緊張素系統，使血管緊張素Ⅱ生成增多，從而導致細胞內鈣超載來實現的［6，7］。近年來有研究表明［8，9］，在 ADR 致 HF的過程中，細胞凋亡起到了重要作用，即使暴露在低于微摩爾濃度ADR中的心肌細胞也會發生細胞凋亡。本實驗表明：采用ADR2.5 mg／kg腹腔注射每周一次持續6周的造模方法是成功的，這與文獻［10］結果一致。20世紀90年代以來，人們逐漸明確心室重塑是HF發生發展的分子細胞學基礎，1996年Narula等［11］率先證實，在HF晚期心肌中存在著細胞凋亡。而心肌細胞凋亡與心室重塑密切相關，是引起心肌細胞缺失的重要機制，在HF由代償向失代償轉變的過程中起著關鍵作用［12，13］。HF發生時左室功能的不斷惡化是心肌細胞凋亡或（和）剩余的心肌細胞收縮功能代償不足的結果，隨著心肌細胞凋亡使心肌細胞大量喪失，進而細胞肥大、纖維化增生，當細胞數量減少到一定程度必然會導致HF進行性惡化［14］。Abdelwahid等［15］研究指出，心肌細胞凋亡在心室重構以及HF的發生發展中起著重要作用，是HF發生的重要機制。本實驗發現，實驗各組均可見典型的細胞凋亡形態，但檢測各組大鼠的細胞凋亡指數后發現，與正常組相比，模型組細胞凋亡指數明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，益心舒組和厄貝沙坦組細胞凋亡指數明顯下降（P＜0.01）。提示在ADR致大鼠HF過程中伴隨有大量心肌細胞凋亡，中西醫治療均能明顯抑制大鼠心肌細胞凋亡，進而延緩HF發展，兩者的作用接近。

細胞凋亡是一個十分復雜的過程，其調控涉及許多基因，其中Bcl-2基因家族是目前最受重視也是第一個被發現參與凋亡調控的基因家族，屬于一類新的癌基因家族［16］。Bcl-2和Bax同屬Bcl-2基因家族成員，在細胞凋亡的調控中起著十分重要的作用，是兩種作用相反的基因表達產物：Bc1-2具有抑制心肌細胞凋亡作用，而Bax促進心肌細胞凋亡，兩種蛋白表達比率（Bc1-2／Bax）常用以表示心肌細胞凋亡的程度［17］。細胞凋亡時促凋亡基因Bax上調，Bcl-2／Bax比值下降。本實驗免疫組化及蛋白半定量測定表明：模型組Bax蛋白表達增強，Bcl-2表達下降，而治療組Bax蛋白表達下降，Bcl-2表達升高。由此提示：益心舒能明顯抑制大鼠心肌細胞凋亡，改善心功能，其作用機制可能與調節Bcl-2、Bax的蛋白表達有關。但值得指出的是：與模型組相比，益心舒組與厄貝沙坦組的Bcl-2／Bax比值無統計學意義（P＞0.05），推測這可能是藥物對Bcl-2和Bax的蛋白表達調節不平行導致的。

HF屬中醫學“心悸”“怔忡”“喘證”“水腫”等范疇，屬本虛標實、虛實夾雜之證，本虛為氣虛、陽虛，標實為血瘀，水濕。臨床上多采用益氣養陰、活血化瘀之法。益心舒膠囊源于著名古方生脈散，在人參、麥冬、五味子的基礎上，添加了丹參、黃芪、川芎及山楂，具有益氣復脈、活血化瘀、養陰生津的功效，臨床常用于HF和冠心病心肌梗死的治療。本實驗表明，益心舒膠囊能明顯降低HF大鼠心肌細胞凋亡率，下調Bax蛋白表達，上調Bcl-2蛋白表達。推測益心舒膠囊可能是通過調控Bcl-2、Bax蛋白表達而發揮其抑制HF心肌細胞凋亡、改善心功能的作用。而且益心舒膠囊益氣活血，臨床改善患者心肌供血作用明顯，是否還通過其他途徑抑制心室重塑，有待于進一步研究探討。

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