煙草蛋白質的利用及提取的研究進展*

劉旭強，李 軍，劉維娟，張艷林，鄭甜田，王亞明

[1.昆明理工大學 化學工程學院，云南 昆明650500；2.云南瑞升煙草技術(集團)有限公司，云南 昆明 650106]

煙草(草煙)是一種多年生草本植物，它具有悠久的種植歷史，生長在世界各地的多處地域，其主要用于商業生產香煙和相關的煙草產品。由于吸煙有害健康和其它禁煙法規的出現，導致煙草的使用前景受到影響，并且對煙農的收入也產生了負面影響。然而，煙草除了制煙吸食，還具有許多其它未開發的價值，尤其是從生化科技方面來看，煙草其實是一種極其豐富的生化資源。

蛋白質是煙草眾多成分中含量最多的一種，其在白肋煙中的含量高達20.48%[1]。隨著人們對蛋白質的研究發現，植物蛋白是利用價值極高的一種蛋白資源，因此漸漸開始關注植物蛋白。植物蛋白可以在醫藥、食用等方面產生巨大的效益，對飲食不足和醫用蛋白昂貴等問題提供了嶄新的解決思路。煙草是提取植物蛋白的良好原料之一，煙草中含有大量的蛋白質，煙草蛋白中各種氨基酸含量極其豐富、均衡，經過精密的高新技術加工后，可以得到生物活性肽和氨基酸等的高附加值產品[2]。而且，煙草作為提取蛋白質的原材料，成本低廉。近年來，相關工作者對從煙草中提取蛋白質也做了大量的研究，使提取工藝合理化。作者綜述了煙草蛋白的提取和利用，旨在為相關研究工作者提供幫助。

1 煙草蛋白質的測定與提取

煙草中含有豐富的蛋白質(煙草蛋白可分為可溶性蛋白質和不可溶性蛋白質，其中可溶性蛋白包括葉綠體蛋白質FⅠ蛋白和蛋白質復合物FⅡ蛋白)，其對煙草的生長具有重要的生物學意義。然而，蛋白質對提高卷煙的質量不會起很大的作用，并且，它是卷煙吸食過程中產生很多對人體有害物質的前體。王瑞新等[3]的研究發現，如果蛋白質的含量過低，就會影響吸味，使卷煙吸食時淡而無味，從而影響到卷煙的質量；如果蛋白質的含量過高，也會影響卷煙的吸味，會產生燒焦羽毛的刺鼻氣味。相反，蛋白質在醫學、化工、生物學等領域卻具有極大的作用。因此，蛋白質的測定與提取具有極其重要的意義。

1.1 煙草蛋白質的測定

1.1.1 凱氏定氮法

煙草蛋白質中含有氮，樣品中的蛋白質會在酸和催化劑加熱的共同作用下分解，產生的氨會與硫酸生成硫酸銨，再堿化，使氨游離。用硼酸吸收，再用硫酸或鹽酸滴定，根據酸的消耗量來確定蛋白質含量。具體操作步驟：取樣品→置于干燥的凱式燒瓶→加入硫酸銅、硫酸鉀、硫酸→炭化，加熱至液體呈藍綠色且澄清定容→定氮蒸餾→堿化蒸餾→計算蛋白質含量[4]。

1.1.2 雙縮脲(Biuret)法

煙草蛋白質含有肽鍵(—CO—NH—)，可以發生雙縮脲反應，堿性溶液中，與二價銅離子作用形成紫紅色的絡合物。而且，其反應呈現的顏色會隨肽鍵含量(即蛋白質含量)不同而不同，因此，可以通過比色法，來檢測蛋白質的含量。雙縮脲法測定蛋白質速度快，但準確度不是很高。具體操作步驟：做標樣7個→分光光度計540 nm處檢測→繪制標準曲線(吸光度為縱坐標，蛋白質體積分數為橫坐標)→通過標準曲線求蛋白質含量。

1.1.3 紫外光譜法

煙草蛋白質分子中的酪氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸殘基的苯環等含有共軛雙鍵，其蛋白質具有了吸收紫外光譜的性質。其吸光度與蛋白質含量成正比，吸收峰為280 nm，溶液在238 nm處的光吸收值與肽鍵含量也成正比。由于干擾物的存在(如核酸，雖有校正，但誤差仍然是存在的)，紫外光譜法對蛋白質含量的測定不夠精確，但是，其操作簡單、方便、樣品消耗量特別少。具體操作步驟：配置濃度依次遞增的8個樣品→混勻→分別測定在280 nm處的吸光度→繪制蛋白質標準曲線→根據蛋白質樣品溶液在280 nm處的吸光度得到其體積分數。

1.2 煙草蛋白質的提取

1.2.1 酸堿提取法

酸堿提取法[5]可以從煙草漿料中提取煙草蛋白質，可以大規模量產。具體步驟為：首先，74 μm濾布過濾，再用濾紙抽濾除雜，用KOH堿溶一次→74 μm濾布過濾，濾渣堿溶2次；使用精密pH計測定pH值→取濾液離心除雜→取上清液，使用H3PO4酸沉→在4 ℃冰箱靜置沉淀蛋白2 h。離心，即可得到蛋白質沉淀。

1.2.2 回收無尼古丁的蛋白質

從煙草中回收不含尼古丁的蛋白質，對煙農提高收益和煙草的應用來說是至關重要的。這個工藝過程是可以實現的。H Fu等[6]得出，通過用(Na2HPO4-KH2PO4)緩沖溶液處理煙草，可得到不含尼古丁的蛋白質，同時，煙草蛋白的分離率也相應得到增加。最佳工藝條件為m(緩沖液)∶m(煙草)=4.75，緩沖液pH=7.85，c(緩沖液)=0.085 mol/L，此時，可溶性蛋白質達到最大產量為12.85 mg/g新鮮煙草。所有研究的方法中最有效的是用丙酮在20 ℃下除去蛋白質中的尼古丁，但是，它也大幅度降低了蛋白質的回收率。超濾也可以去除所含尼古丁，而且蛋白質的回收率高達94.5%。但是，超濾只能除去50%的殘留尼古丁。用質量分數為85%的磷酸在pH=3.5的條件下清洗3次，可以除去殘余在蛋白質中的尼古丁，蛋白質的回收率為94.5%。H Fu等通過用(Na2HPO4-KH2PO4)緩沖溶液處理煙草的規?；M行，將為進一步工業化規模生產不含尼古丁的煙草蛋白提供堅實的基礎。

2 煙草蛋白質的綜合利用

“禁止吸煙”會對煙草行業造成巨大沖擊，會讓煙農擔心煙草的銷量問題，煙草的合理利用將直接關系到煙農的利益。高濃度煙草蛋白質的提取和利用，給了解決這一問題的新思路。

2.1 應用于飼料

通過Ames的實驗[7](污染物致突變性檢測)證明，不含尼古丁的蛋白質不會誘發動物變異。研究發現[8]，煙草蛋白質的營養價值極高，在各種植物蛋白營養價值比較中非常突出，其營養價值和牛奶相近，高于大多數的植物蛋白質。從煙草中提取出來的蛋白質含有豐富的氨基酸，其中蘇氨酸和色氨酸等遠高于魚骨粉做的動物飼料，是良好的天然營養動物飼料和飼料添加劑。

2.2 應用于食品

人口增多，可利用資源減少，充足的飲食依然是世界性問題。煙草蛋白質營養豐富，在植物蛋白質營養排序中，煙草蛋白居于榜首。郭培國等[9]相關工作者研究發現，從煙草中提取的煙草蛋白營養高于奶酪和雞蛋，可以用來制作奶酪和作為雞蛋替代品。早在20世紀70年代，美國生物學教授塞繆爾·威爾海曼發現了一種從煙草植物中提取的蛋白，其營養價值超過了牛奶中的酪蛋白。提取得到煙草蛋白可以如制作豆腐一樣，制成煙草蛋白豆腐，這種豆腐嫩滑，口感極好。目前，很多食品添加劑都存在安全隱患，用煙草蛋白可以制成無毒、天然、營養食品添加劑，煙草蛋白還可通過加工制成各種營養食品，供給食用。

通過使用內外切蛋白復合酶，將蛋白質進行可控的分解，由于分解程度的不同，可以得到多種的氨基酸和活性肽。通過多級膜分離、吸附分離和離子交換等技術處理可得到目標產物，再經過一系列的后續加工，就可得到具有特殊功能的食品[10]。

2.3 應用于醫藥

煙草蛋白質具有高純度、低鹽分、眾多氨基酸組成且平衡等特性，可以供給腎臟病人、忌鹽患者和燒傷病人等使用。郭俊成等[11]國內科學工作者近年來證實，組分-Ⅰ蛋白具有抗氧化性，含有硒的組分-Ⅰ蛋白抗氧化性會更強。硒是人體必需微量的元素之一，而且，硒在防治克山病、大骨節病、癌癥及腫瘤等方面具有重要的作用。硒蛋白在脂質過氧化方面明顯要好于不含硒的蛋白質，硒的抗氧化作用可以清除細胞體系的活性氧化基和化學反應生成的自由基，可以阻止它們對肝臟的傷害，防止肝病向癌癥的轉化。煙葉硒具有低毒、高效等特點，其具有很大的開發前景，而且，我國衛生部已經批準煙葉硒蛋白作為添加劑制作食品和醫藥保健品。

美國佛羅里達生物技術研究所[12]已經成功的建立了一條煙草蛋白生產線，來從煙草中提取蛋白質供給藥用。加利福尼亞州的一家生物遺傳公司于1990年將煙草植物花葉病毒引入藥草植株內，生產出病毒編碼蛋白。煙草蛋白質具有很高的藥用價值，等待相關科研工作者的開發利用。

2.4 轉基因作用于植被

經研究發現[13]，有種特殊的cDNAs存在于煙草花的蜜腺中，它能產生出特殊的蛋白酶，這種蛋白酶可以抵抗微生物，保護植被不受微生物的損害?，F今正在進行轉基因的研究，研究如何將這種cDNAs轉移到其它植被中去。如轉移到農作物中，用來抵抗微生物的侵害，就會減少農藥的使用，既降低了農作物的種植成本，還減少了農作物的藥物殘留，又有利于環境保護。

其它植被的cDNAs也可以通過轉基因技術轉移到煙草中，通過煙草來生產其它植被的蛋白質。如將大豆球蛋白的cDNAs轉移到煙草的基因組中，在煙草種子中以一種特殊的方式產生出大豆球蛋白，并且，其產出的蛋白質的質量、特性、功能等與大豆球蛋白并無多大區別[14-15]。

2.5 制備生物活性肽

通過酶的水解作用，煙草蛋白質可以分解為許多種生物活性肽，其中，有簡單的二肽，也有經過糖苷化、磷酸化的復雜長鏈或環狀多肽。目前，生物科技研究發現[16]，生物活性肽具有調節免疫力、激素、調節神經、抵抗病毒、抵御癌癥和高血壓、抗氧化衰老等許多種生理功能，這對人類健康起著不可忽視的重大影響。如，將生物活性肽添加到食物當中，可以加工成抗癌、抗高血壓、提高免疫力等特定功能的食品或藥物。目前，對于從煙草蛋白中提取活性肽的報道并不多見，煙草蛋白質作為提取生物活性肽的重要潛在資源之一，有待相關研究人員的開發利用。

2.6 通過Maillard反應制備香辛香料

通過酶的可控水解作用，煙草蛋白質會分解為多種氨基酸和生物活性肽，其中，低次煙草的酶解液可以與還原糖、醇等發生Maillard反應，生成醬香、果香、煙草香、中藥香等各種濃郁香味的無毒香料。這些香料可以制成煙草香辛香料或食用香料。美拉德反應(Maillard Reaction)亦稱非酶褐變反應(Non-enzymatic Browning Reaction)，是在1912年，由L C Maillard提出的，主要研究還原糖和氨基酸、蛋白質之間的復雜反應[17-18]。研究發現[19]，卷煙中焦油含量的增加會使相關疾病的發病率提高，而降低焦油的含量，則會使卷煙的香味降低、吸味減弱、影響卷煙的質量，這一直困擾著卷煙的制造者。美拉德反應制取的香料則會掩蓋低焦油卷煙的雜氣、降低刺激性氣味、提高香氣，在改善卷煙的質量和吸味上會具有很明顯的作用。因此，國內外對通過Maillard反應制備香辛香料提高卷煙吸味的研究廣泛關注。

3 結束語

現今，生化技術迅猛發展，分子技術特別是基因改造技術進展巨大，對煙草蛋白質進行特定的基因改造，生產特定功能的蛋白質已經不是難題。并且，絕大多數蛋白質基因均可導入煙草中進行表達，得到改造后的特定煙草蛋白質，進而用來生產特定功能的蛋白質，如具有抗菌、抗癌等功能的蛋白[20]。煙草蛋白質可以通過提取、后續加工，直接生產成無毒營養食品添加劑和各種豐富的營養食品、動物營養飼料和飼料添加劑，還可以用來生產藥用蛋白。煙草蛋白在醫藥、飲食、生化等方面有著顯著的開發前景?，F在“禁止吸煙”的標志越來越常見，煙草的消耗會隨之減少，這給煙農帶來了巨大的壓力，而煙草蛋白的提取、利用將會使煙草的消耗量增加，會直接給煙農帶來經濟利益?？梢灶A見煙草蛋白質的廣闊發展前景，其很可能將成為人類未來蛋白質的主要來源之一。煙草蛋白的巨大潛在價值及應用仍然有待相關科研工作者的研究開發。

[ 參 考 文 獻 ]

[1] Vansuyt G,Souche G,Straczek A,et a1.Flux of proteins released by wild type and ferritin over-expressor tobacco plants：effect of phosphorus and iron nutrition[J].Plant Physiology and Biochemistry,2003,41:27-33.

[2] Qingshun Li,Christopher B,Lawrenee H,et al.A tridecapeptide possesses both antimicrobial and proteaseinhibitory activities[J].peptides,2002,23:1-6．

[3] 王瑞新.煙草化學[M].北京:中國農業出版社,2003:46-51.

[4] 寧正祥.食品成分分析手冊[M].北京:中國輕工業出版社,1998:72-73.

[5] 趙謀明,饒國華,林偉鋒,等.低次煙葉中蛋白質提取工藝優化及氨基酸分析研究[J].農業工程學報,2006,22(1):142-146.

[6] H Fu,P A Machado,T S Hahm,et al.Recovery of nicotine-free proteins from tobacco leaves using phosphate buffer system under controlled conditions[J].Bioresource Technology,2010，110:2034-2042.

[7] Ames B N,et al.Methods for detecting carcinogens and mutagens with the salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test[J].Mutation Res,1975,31:347-364.

[8] Gucnounc Dana,Amir Rachel,Ben-Dor Bruria,et a1．A soybean vegetative storage protein accumulates to high levels in various organs of transgenic tobacco plants[J].Plant Sci，1999,145:93-98．

[9] 郭培國,李榮華,陳建軍.煙葉中FI蛋白的簡捷提取技術及其氨基酸成分分析[J].中國煙草學報,2000,6(2):16-19.

[10] 李恩民,劉維全,殷震.抗菌肽的特性及其應用前景[J].中國藥理學通報,1998,14(3):209-211．

[11] 郭俊成,蘇勇,劉強,等.煙草葉蛋白利用價值研究進展[J].中國煙草科學,2006(1):8-10.

[12] 魏榮寶.煙草植物在有機醫藥和農藥中的應用[J].化學教育,2009(7):1-4.

[13] Thornburg R W,Carter C,Powell A,et al.A major function if the tobacco floral nectary is defense against microbial attack[J].Plant Systematics and Evolution,2003,238(1-4):211-218.

[14] Fumio Takaiwa,Tomoyuki Katsube,Sayuri Kitagawa,et a1.High level accumulation of soybean glycinin in vacuole-derived protein bodies in the endosperm tissue of transgenic tobacco seed[J].Plant Sci,1995,111:39-49.

[15] Trainotti Livio,Pavanello Anna,Casadoro Giorgio.Differential expression of genes in apical and basal tissues of expanding tobacco leaves[J].Plant Sci,2004,167:679-686.

[16] 王竹青,李八方.生物活性肽及其研究進展[J].中國海洋藥物雜志,2010,29(2):60-68.

[17] 李亞麗,劉曉徐,鄭培華,等.美拉德反應研究進展[J].食品科技,2012,37(9):82-87.

[18] 畢莉莎,李璠,劉志華.美拉德反應產物的抗氧化性及在煙草中應用研究進展[J].云南化工,2010,37(1):58-61.

[19] Deutsch M E.Less-toxic cigarette use may backfire[J].Science,2009,325(5943):944.

[20] 張平遠.英美加速開發煙草食用蛋白[J].食品科技,1995(1):12-14.