功能性人工窖泥培養配方篩選研究

姚萬春，唐玉明，任道群，劉茂柯，田新惠，劉 淼

（1.四川省農科院水稻高粱研究所，四川 瀘州 646000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000）

自古以來，窖池都是濃香型大曲酒生產的主要設備。要產好酒，就必須有好的窖池，而好的窖池其本質在于優質的窖泥[1]。窖泥質量不僅在于其理化指標豐富程度，更取決于其中有益窖泥功能菌的種類、數量及產物的代謝能力，以及營養成分的合理比例[2]。正是由于這些有益功能菌的大量生長、繁殖、代謝以及相互協調作用，才賦予了白酒的獨特香型，造就了以己酸乙酯為主體香的濃香型白酒的典型風格[3-4]。因此，窖泥質量的優劣對濃香型白酒的質量起著至關重要的作用。但是傳統人工窖泥在生產過程中有兩個突出問題：新窖泥自然老熟時間太長；使用一段時間后窖泥會老化而影響酒的品質[5-6]。而在傳統人工窖泥培養的基礎上，通過采取加入協調而全面的優良菌種、科學合理的培養配方及認真細致的生產管理等措施培養功能性人工窖泥，增大窖泥中有益微生物菌群和各種營養成分，并加速其老熟，以縮短自然老熟時間，使濃香型白酒的生產特別是優品率穩定在一個較高的水平，提高白酒企業的經濟效益[7-10]。

本研究遵循窖泥功能菌生存的自然環境條件，應用微生物營養、培養基成分調節理論，通過窖泥成分調控，培養出不同配方的功能性人工窖泥。通過對窖泥的感官鑒定以及理化、微生物指標的對比研究，判斷窖泥的老熟情況，初步篩選出功能性人工窖泥最適宜的培養配方，為其產業化提供可靠的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 窖泥培養原料

基礎泥：選用瀘州當地氮（N）、磷（P）、鉀（K）含量豐富，比例協調，且pH值適中的菜地黃泥土（要求土質細膩綿軟、微酸性、無夾沙、無污染，須曬干破碎）；老窖泥、窖皮泥、酒糟、黃漿水：來自瀘州老窖酒廠（老窖泥要求窖齡長、酒質好的池中色澤灰褐、柔軟細膩、酯香突出的優質窖泥；窖皮泥、酒糟、黃漿水來源于正常發酵的窖池）；豆餅粉：市購（要求無霉變、無蛀蟲、無異味）；大曲粉：瀘州老窖大曲生產廠；混合鹽、乙酸鈉（化學純）：成都科龍試劑公司，銨鹽、磷酸鹽、鎂鹽按5∶4∶2的比例混合成混合鹽；復合功能菌液：本實驗室培養（黃褐色懸掛液體，聞有己酯香味，微酸，發酵旺盛）；氣相色譜所用試劑均為市售色譜純。

1.1.2 復合功能菌液種源

瀘州市釀酒科學研究所從400年老窖池中篩選的窖泥功能菌株（己酸菌）與優質老窖泥混合培養。

1.2 儀器與設備

DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；HHS-21-8電熱恒溫水浴鍋：上海搏迅實業有限公司醫療器械廠；7230 G可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；DRP-9082電熱恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司：HD-1360型超凈工作臺：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；LDZX-50KBS型高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；Agilent6820氣相色譜儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥菌體數檢測方法

稀釋平板計數法[11]。

1.3.2 窖泥理化指標測定[12]

水分-烘干法；pH值-電位法；腐殖質-重鉻酸鉀氧化法；氨基酸態氮-半微量開氏法；有效磷-分光光度法。

1.3.3 氣相色譜法測定窖泥的微量成分測定[13]

窖泥中微量成分的提?。簻蚀_稱取10 g窖泥→加50 mL無水乙醇→冰浴研磨后密封→浸取12 h→倒出上清液→再加50 mL體積分數為65%乙醇→冰浴研磨后密封→浸取12 h→將兩次浸取液混勻→5 000 r/min冷凍離心15 min→上清液用微孔濾膜過濾→濾液用于色譜分析。

氣相色譜分析條件：使用高純氮氣為載體，流速1.8 mL/min，尾吹氣約30 mL/min。初始柱溫40 ℃，保持4 min，以5 ℃/min升溫至120 ℃，保持15 min，再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持10 min。進樣口溫度為230 ℃，檢測器溫度為240 ℃。

1.3.4 配方原則

通過對窖泥理化與微量成分及其微生物的生活習性研究，從優質窖泥中廣泛篩選優良有益菌，并誘變選育出優良窖泥功能菌。采用純功能菌與老窖泥混合培養的復合功能菌液為種源，選擇適宜的基礎泥，模擬老窖泥中有益菌的生長條件添加輔料與營養物質，以滿足窖泥功能菌生長、繁殖及次生代謝對養分、水分等環境條件需求。從有利于富集窖泥有益微生物所需的水分、pH值、碳、氮、磷、鉀等因素綜合考慮，使有益微生物在良好環境條件下生長繁殖，從而使窖泥盡快達到老熟[14]。

1.3.5 配方設計

上述原料根據不同組合和比例進行正交試驗，從試驗結果中選出較為理想的5種配方繼續擴大培養試驗，其配方設計見表1。

1.3.6 培養方法

窖泥培養方法要模擬窖內微生物的生存環境條件，遵循老窖自然形成規律，選擇一條科學合理的生態路線[15]。不論采用什么配方，都要精心操作，細心管理，才能達到培養優質窖泥的目的。功能性人工窖泥培養采用兩次發酵法，即將固體、液體物料和菌液混合均勻堆積發酵14 d后取樣檢測，根據檢測結果適當補充水分，混合均勻后再入池發酵，35 ℃恒溫培養60 d。

表1 各配方輔料占基礎泥的比例Table 1 Proportion of auxiliary material in different formulations by basic mud%

2 結果與分析

按照1.3配方和方法制作功能性人工窖泥，35 ℃恒溫培養60 d后進行窖泥感官鑒定及理化、微生物指標與微量成分分析檢測。

2.1 不同配方功能性人工窖泥中厭氧功能菌數量測定

功能性人工窖泥培養沒有盲目添加窖泥微生物營養需要的水果、糧食原料等，而是主要利用黃水、酒尾、糟醅等釀酒廢料，以便富集和馴化窖泥中的有益微生物。對不同配方功能性人工窖泥中厭氧功能菌數量進行測定，其結果見表2。

厭氧菌是窖泥中的有益功能菌群，其數量決定著窖泥質量。由表2可知，由于所有配方窖泥中都加入了以己酸菌為主的復合窖泥功能菌液，所以各配方的厭氧功能菌均以己酸菌為主。配方1的厭氧功能菌數量比其他配方少，特別是硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌；己酸菌、丁酸菌、甲烷菌及厭氧功能菌總數均是配方4和配方5接近，配方2和配方3接近，前者多于后者。窖皮泥分析原因可能是由于配方1中沒添加窖皮泥，導致其菌種種源少。說明培養人工窖泥時，在對酸度予以調整的前提下，盡可能加大黃水的用量，充分利用黃水中含有大量營養物質和窖泥微生物的有利條件；加入適量的黃水、酒糟、豆餅粉和酒尾營養物質后，可以不必加入乙酸鈉；添加優質窖皮泥會豐富人工窖泥的種源。

2.2 不同配方功能性人工窖泥理化指標檢測分析

對不同配方功能性人工窖泥的理化指標進行檢測，其結果見表3。

一般認為成熟窖泥的水分含量介于38%～45%之間[16]。由表3可知，以上配方窖泥樣品的水分含量差異不大，均屬于正常范圍。上述各配方窖泥pH值在5.5～6.7之間，與己酸菌生長的適宜范圍pH 5.8～6.8[17]基本接近，配方4和配方5中由于添加的黃水比例比其余配方大，使其窖泥pH值要偏低些，但仍在己酸菌產己酸要求的pH值5～7[18]的范圍內。各配方氨基酸態氮、有效磷、腐殖質含量比較：配方1沒有添加窖皮泥和乙酸鈉，腐殖質含量最低，氨基酸態氮和有效磷含量較低；配方2沒有添加營養鹽和乙酸鈉，氨基酸態氮和有效磷的含量最低，腐殖質含量較低；配方3沒有添加乙酸鈉，氨基酸態氮、有效磷、腐殖質含量都居中；配方4沒有添加乙酸鈉，但添加的黃水較多，氨基酸態氮含量最高，有效磷和腐殖質含量高于配方3低于配方5；配方5不但添加的黃水較多，還添加了乙酸鈉，氨基酸態氮含量與配方4接近，有效磷和腐殖質含量最高。

窖泥中腐殖質是土壤中各種營養元素，特別是碳（C）、氮（N）、磷（P）的重要來源，是土壤微生物生物活動的產物，它可以全面反映窖泥對微生物的營養供應[19]；氨基酸態氮、有效磷是窖泥微生物生長、繁殖所必需的速效元素，無疑對窖泥功能菌的富集和馴化起到積極的促進作用[20]；據前人研究，老窖泥中的總酸總酯含量高于人工窖泥，它們含量高低可以判斷窖泥優劣。

2.3 不同配方功能性人工窖泥的感官鑒定

窖泥質量判定標準由兩部分組成，一是理化和微生物分析檢測，二是感官鑒定。以感官鑒定為主，理化微生物數據為基本要求[21]。培養成熟的不同配方功能性人工窖泥，其質量經專家鑒定，結果見表4。

表4 不同配方功能性人工窖泥的感官鑒定Table 4 Sensory evaluation of man-made pit mud with different formula

由表4可知，本次試驗選用的5個配方培養的功能性人工窖泥感官總體看來均可，但從色澤、氣味、手感幾個方面綜合考慮，配方5香氣更純正，酯香和窖香味更濃烈。因此，配方5培養的人工窖泥老熟程度最好，更適合用于濃香型白酒生產。

2.4 不同配方功能性人工窖泥的微量成分檢測

長期以來，人們對窖泥質量的判別主要是依靠感官鑒定和一些理化分析數據，如色澤、手感、氣味、水分、腐殖質、氨基酸態氮、有效磷和芽孢菌數等指標來衡量窖泥的優劣[22]。目前，生產上尚未發現一種有效判定窖泥質量好壞的指標體系，窖泥感官的評價能否上升到微量成分的檢測評價，這值得釀酒研究工作者進一步探索和研究。為此，本研究在對窖泥感官鑒定及理化、微生物分析的同時，還結合窖泥的微量成分進行比較分析。不同配方功能性人工窖泥的微量成分檢測結果見表5。

由表5可知，各類微量成分在配方間的差異，酯類化合物最大，其次是酸類化合物，醛類和醇類化合物在配方間的差異均不明顯?？偽⒘砍煞衷谂浞介g有差異，其種類的差異大于含量的差異。配方4和配方5的總酯種類及含量最多，種類分別為5種、6種，含量分別為0.198 9 g/100 g、0.221 9 g/100 g；配方4和配方5總酸種類及含量最多，種類均為7種，含量分別為2.652 5 g/100 g、2.728 1 g/100 g；配方4和配方5總微量成分種類及含量最多，種類分別為16種、17種，含量分別為3.334 g/100 g、3.384 9 g/100 g；配方4和配方5總酸、總酯、總微量成分含量均高于其他配方。

據前人研究，老窖泥中的總酸總酯含量高于人工窖泥，它們的含量高低可以判斷窖泥優劣。由此判斷，配方4和配方5的窖泥質量優于其他配方。再根據總酯、總酸、己酸、己酸乙酯含量與總微量成分含量及其種類判斷，二者之中添加乙酸鈉的配方5最優。由此可以初步推斷，培養人工窖泥時添加適量的乙酸鈉是十分必要的。

表5 不同配方功能性人工窖泥的微量成分Table 5 Trace composition of man-made pit mud with different formulag/100g

3 結論

3.1 從微生物的角度來講，配方4和配方5的厭氧菌群較多，適用于功能性人工窖泥培養；從理化指標看，配方4和配方5的窖泥中氨基酸態氮、腐殖質、有效磷等營養成分含量豐富，更有利于釀酒微生物的生長繁殖；從感官鑒定看，配方5老熟程度更好。幾項指標綜合看，配方5是功能性人工窖泥最適合的培養配方。

3.2 配方5培養的窖泥，經感官鑒定其老熟程度更好，經色譜檢測其總酯、總酸、己酸、己酸乙酯及總微量成分含量更高，酸、酯類化合物及總微量成分種類更多。借此初步推斷，窖泥感官的評價可能與微量成分的檢測評價相關。

3.3 應用微生物營養、培養基成分調節理論，通過窖泥成分調節，并輔以嚴格的培養工藝，能夠有效提高人工窖泥質量。在以后的生產工作中，應進一步研究完善相關的理論、技術，大膽運用于濃香型白酒生產，不斷提高濃香型白酒的質量和技術水平。

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