氨基酸對紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響

田 園，魯華敏，周 波 *，鐘海雁

（1.稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，湖南長沙 410004；2.糧油深加工與品質控制湖南省重點實驗室，湖南長沙 410004；3.中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南長沙 410004）

紅曲發酵歷史悠久，關于紅曲方面的研究主要集中在次級代謝產物的開發利用上，許多學者對紅曲霉菌代謝產物種類及其功能性等方面做了較多研究，其中紅曲色素是研究較多且應用廣泛的主要次級代謝產物[1-2]。目前完全確定結構的紅曲色素有十幾種，其中發現并確定結構的紅曲黃色素有六種，如安卡紅曲黃素（ankaflavin）和紅曲素（monascin）[3]、xanthomonasin A 和xanthomonasin B[3]、monascusones A和monascusones B[4]。紅曲黃色素不僅因其較好的耐熱性和耐酸性而廣受食品生產者和研究者的喜愛，還具有一定的生物活性，如monascin及其衍生物對小鼠T細胞有免疫抑制作用[5]，能減低皮膚癌的出現幾率[6]；ankaflavin通過調控細胞凋亡相關聯的機制對癌細胞株有選擇性細胞毒性等[7]，但因菌種的缺乏，有關紅曲黃色素工業化生產的研究報道較少[8-10]。

本實驗室通過物理化學誘變獲得一株高產黃色素的紅曲霉突變菌株（Monascus ankamutant）[9]，并對其合成代謝黃色素的特性進行了一定的研究，證實其合成代謝的黃色素是安卡紅曲黃素（ankaflavine）和紅曲素（monascin）[10-13]，這說明紅曲霉突變菌株合成代謝紅曲色素和橘霉素的機理跟其他紅曲霉菌種合成代謝色素和橘霉素的機理基本一樣。已有相關研究報告說明氨基酸對于紅曲紅色素和橘霉素的合成代謝是一個非常重要的影響因子[14]，且相關氨基酸在一定程度能與紅曲色素發生一定的反應生成色素衍生物[15]，在本實驗中，根據紅曲色素和橘霉素合成代謝的相關報道[4，14，16-18]，來研究氨基酸對紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響，希望能為紅曲黃色素和橘霉素的合成代謝機理的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紅曲霉突變株菌（Monascus ankamutant）：華南理工大學生化工程研究室選育并保存。

1.1.2 試劑

玉米粉：市售；氨基酸（分析純）：上海國藥集團化學試劑有限公司；其余化學試劑均為分析純：廣州市化學試劑廠。

1.1.3 培養基

斜面種培養基采用麥芽汁瓊脂培養基：瓊脂20 g/L，麥芽汁濃度為6 °Bé。

種子培養基：玉米粉30 g/L，硝酸鈉3 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，磷酸二氫鉀4 g/L，pH 6.0。

發酵培養基：氯化銨15 g/L，可溶性淀粉70 g/L，葡萄糖20 g/L，玉米漿10 g/L，KH2PO45 g/L，初始pH 4.0。

培養基均121 ℃蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

2802SUV/VIS紫外可見光分光光度計：上海尤尼科斯科學儀器有限公司；C25KC型全溫搖床：美國New Brunswick Scientific公司；SPX-250B-Z型生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；ER-180A 型電子天平：日本A&D公司；Aglient 1100高效液相色譜：美國安捷倫科技有限公司；Scientz IID超聲波細胞破碎機：寧波新芝生物科技股份責任有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養和發酵方法

斜面種在32 ℃培養2～3 d；種子液32 ℃、160 r/min培養2～3 d；搖瓶發酵條件為250 mL三角瓶裝30 mL培養基，160 r/min、32 ℃培養7 d，所有發酵實驗均三個平行，計算平均值。

1.3.2 分析方法[19]

胞外色價測定：取一定體積的發酵液，4 000 r/min離心20 min，上清液經定性濾紙過濾，濾液稀釋至適當倍數，用分光光度計在波長410 nm下測定其OD410nm值，此值乘以稀釋倍數即為胞外黃色素色價；在波長510 nm下測定其OD510nm乘以稀釋倍數即為胞外紅色素色價，色價單位用U/mL表示。

胞內色價測定：離心后的菌體沉淀用體積分數為70%乙醇抽提1 h，然后4 000 r/min離心20 min，上清液過濾，濾液稀釋至適當倍數，測定其OD410nm，此值乘以稀釋倍數即為胞內黃色素色價；測定其OD510nm值乘以稀釋倍數即為胞內紅色素色價，色價單位用U/mL表示。

總黃色素色價的計算：總黃色素色價（U/mL）=胞外黃色素色價＋胞內黃色素色價。

色調的計算：色調=黃色素色價/紅色素色價。

細胞干質量（dry cell weight，DCW）的測定：吸取5 mL發酵液，4 000 r/min離心20 min，去上清液，沉淀用蒸餾水洗滌，4 000 r/min離心20 min，去上清液，重復三次后沉淀于80 ℃烘箱中烘至質量恒定。

橘霉素的檢測：5 mL 發酵液用5 mL體積分數為95%的乙醇抽提1 h，通過超聲波細胞破碎機破碎后于4 000 r/min離心20 min，離心上清液通過濾紙過濾，濾液再用0.45 μm有機系膜過濾，吸取濾液20 μL來進行橘霉素色譜檢測。

HPLC檢測條件：Aglient 1100的高效液相，柱為Eclipse XDB reverse C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫28 ℃，檢測器為紫外檢測器（λ=254 nm）；流動相（用色譜純磷酸調pH至2.5）為乙腈/水（35∶65），流動相流速為1.0 mL/min[20]，進樣量20 μL。

以橘霉素質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，得到橘霉素測定標準曲線回歸方程為：y=27.11x-70.647（R2=0.995 1）。

2 結果與分析

2.1 甘氨酸對紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響

圖1 甘氨酸含量對紅曲黃色素色調(A)及色價(B)和橘霉素(C)的影響Fig.1 Effect of glycine content on Monascus yellow pigments hue (A),color value (B) and cirtinin (C)

由圖1A及圖1B可知，添加適量的甘氨酸有利于黃色素的合成代謝，從色價考慮，最適甘氨酸添加量為2g/L，此時發酵得到的總黃色素色價增加量分別是沒添加甘氨酸發酵時的69.82%，再增加甘氨酸的添加量時，黃色素色價的增加趨勢出現下降，且黃色素色調下降很快，這說明甘氨酸不僅有利于黃色素的合成代謝，也有利于紅色素的合成代謝。綜合色價及色調考慮，甘氨酸添加量1g/L為宜。

由圖1C可知，添加甘氨酸能明顯促進橘霉素合成代謝，當甘氨酸添加量為6 g/L時，橘霉素的合成代謝量是對照組的6.61倍，提高561%，橘霉素生成量為3.37 mg/L。在本實驗中甘氨酸添加使得發酵液pH上升，橘霉素生成量上升，這說明甘氨酸可能參與了橘霉素的合成代謝，或許為橘霉素的合成代謝提供了結構骨架，至于具體原因有待實驗的進一步討究。

2.2 酪氨酸對紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響

圖2 酪氨酸含量對紅曲黃色素色調(A)及色價(B)的影響Fig.2 Effect of tyrosine content on Monascus yellow pigments hue (A) and color value (B)

由圖2可知，添加酪氨酸對胞內黃色素的產量有明顯的提高，但當酪氨酸添加量＞4 g/L時，黃色素產量呈現下降趨勢。對于胞外黃色素而言，添加酪氨酸對其影響不明顯。酪氨酸添加量為4 g/L時，胞內和總黃色素色價都達到最大，分別比沒添加酪氨酸時高出44.10%和42.46%。同時隨著酪氨酸的添加，黃色素色調呈現下降趨勢，但都＞2。綜合色價及色調，酪氨酸添加量4 g/L為宜。

結果表明，一定添加量的酪氨酸明顯有利于黃色素的合成代謝且發酵液黃色素色調下降較慢，同時對橘霉素合成代謝影響不明顯，發酵液中并沒有檢測到橘霉素，相比于甘氨酸而言，酪氨酸更適合于作為培養基中的一種底物來促進黃色素的合成代謝。

2.3 亮氨酸對紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響

圖3 亮氨酸含量對紅曲黃色素色調(A)及色價(B)和橘霉素(C)的影響Fig.3 Effect of leucine content on Monascus yellow pigments hue (A),color value (B) and cirtinin (C)

由圖3可知，亮氨酸的添加對黃色素生成量和色調的影響不明顯。當亮氨酸添加量為3 g/L時，總黃色素色價相比于沒添加亮氨酸發酵時只高出5.94%。從色調和色價的綜合來看，亮氨酸對紅曲色素的合成代謝沒有明顯的促進或抑制作用。綜合色價及色調考慮，不添加亮氨酸添為宜。

隨著亮氨酸的添加，橘霉素的合成代謝受到一定的消除影響，如當亮氨酸添加量為6 g/L和1 g/L時，橘霉素生成量分別為0.36 mg/L和0.47 mg/L，分別是不添加亮氨酸發酵時橘霉素生成量的70.59%和92.16%，分別下降29.41%和7.84%（見圖3C），但是至于具體影響原因可能是因為亮氨酸不利于突變菌株的生長而導致橘霉素代謝生成量下降，也可能是亮氨酸影響了相關酶的活性從而導致橘霉素的合成代謝受到一定的影響。

2.4 天冬氨酸對紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響

由圖4可知，添加適量的天冬氨酸是有利于黃色素的合成代謝，當天冬氨酸添加量為1 g/L時，此時胞外、胞內和總黃色素色價分別高出沒添加天冬氨酸時的29.30%、10.019%和12.29%。綜合色價及色調考慮，天冬氨酸添加量1 g/L為宜。

實驗結果表明，添加適量的天冬氨酸（1 g/L）是較有利于黃色素的合成代謝且發酵液黃色素色調也不會明顯下降，但天冬氨酸對橘霉素的合成代謝不能起到明顯的消除效果（見圖4C）。當天冬氨酸添加量為4 g/L時，橘霉素生成量最大，為1.02 mg/L是不添加時的2.43倍。

2.5 其他氨基酸對紅曲霉突變菌株合成代謝黃色素和橘霉素的影響

在本實驗中還研究了幾種氨基酸（如苯丙氨酸、組氨酸、纈氨酸、脯氨酸和精氨酸）對黃色素色價的影響，結果見表1。由表1可知，相比于沒添加氨基酸發酵時的黃色素色價而言，隨著各種氨基酸的添加量從1 g/L增加到6 g/L，黃色素色價減少量都≥20%，有些黃色素減少量甚至達到83.15%（如苯丙氨酸），結果都表明這些氨基酸對黃色素色價都有不利的影響。

表1 氨基酸對黃色素色價的影響Table 1 Effect of amino acid on Monascus yellow pigments color value

氨基酸不利于黃色素的合成代謝很可能是兩個原因的結果造成，一是氨基酸對紅曲霉突變菌株的生長造成不利從而影響了黃色素量的積累；最主要的原因是氨基酸從代謝途徑上影響了黃色素的合成代謝，抑制了黃色素的合成從而導致黃色素色價下降。

就橘霉素而言，絕大部分氨基酸對橘霉素的合成代謝能起到一定的消除效果，結果見表2。并且隨著氨基酸質量濃度的增加，橘霉素的合成代謝受到的抑制作用越明顯，如添加纈氨酸使得橘霉素含量從0.88 mg/L到未檢測出來，組氨酸的添加是最明顯能消除橘霉素的合成代謝。

表2 氨基酸對橘霉素合成代謝的影響Table 2 Effect of amino acid on citrinin production by Monascus anka mutant

3 結論

不論從基因水平還是酶水平，氨基酸作為氮源對于紅曲色素的合成代謝的調控十分復雜，尤其是有些氨基酸本身參與了色素的合成，如有報道亮氨酸的存在導致了紅曲紅色素的降解[21]，但是在本研究亮氨酸對紅曲黃色素的合成代謝影響不明顯，從色調上也并沒有體現出亮氨酸對紅曲紅色素合成代謝有不利的影響。組氨酸、甘氨酸、酪氨酸和精氨酸有利于紅色素的合成，可以通過副產物蘋果酸的生成來解釋，因為紅色素的生成跟蘋果酸的積累有關[22]。

最近研究報道在化學合成培養基條件下，添加不同的氨基酸來研究其對紅色素和橘霉素合成代謝的影響，發現添加甘氨酸、酪氨酸、精氨酸、絲氨酸和組氨酸有利于Monascus ruberATCC 96218合成代謝紅色素，同時能明顯抑制橘霉素的合成代謝，谷氨酸、丙氨酸和脯氨酸能有利于橘霉素的合成代謝。組氨酸不僅能有利紅色素的合成代謝，更能完全消除橘霉素的合成代謝，其歸結于組氨酸形成的H2O2的功勞[14，23]。對于其他真菌毒素，如寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）和皮殼青霉（Penicillium crustosum）中的赭曲霉素，氨基酸對其也有同樣的效果[24-26]。在本研究中，除了酪氨酸和甘氨酸明顯有利于黃色素合成代謝外，其余都不利于黃色素的合成代謝或影響不明顯，尤其是組氨酸和精氨酸的添加非常不利于黃色素的合成代謝。半胱氨酸鹽酸鹽、苯丙氨酸、組氨酸、纈氨酸和脯氨酸能明顯消除橘霉素的合成代謝，但是甘氨酸能促進橘霉素的合成代謝，其機理還不清楚，有待進一步研究，而其他的氨基酸對橘霉素的合成代謝影響不是很明顯。本文作者認為氨基酸消除橘霉素的合成代謝主要有兩個原因：一是氨基酸在代謝當中產生一些化學物質導致橘霉素的合成代謝受到不利影響，如組氨酸在代謝途徑中產生了過氧化氫，破壞了橘霉素的化學結構，從而使得橘霉素含量下降[27]；二是因為氨基酸對橘霉素的合成代謝途徑有一定的抑制作用。

從工業化生產黃色素角度考慮，通過添加4 g/L的酪氨酸不僅有利于Monascus ankamutant合成代謝黃色素，還能降低橘霉素的代謝生成量。

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