人A組輪狀病毒結構蛋白VP7原核表達及其卵黃抗體效價的研究

李丙超，李再新，胡衛東，黃永生，唐文才，張 智

(1.四川理工學院 a.生物工程學院;b.化學與制藥工程學院，四川 自貢 643000;2.富順縣人民醫院，四川 自貢 643000)

引 言

輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，其中人A組輪狀病毒是引起嬰幼兒急性胃腸炎的最主要病原體，可造成嚴重脫水甚至危及生命。全球每年約有1.4億人發生輪狀病毒腹瀉，并導致大約80萬兒童死亡［1］。人A組輪狀病毒為雙鏈RNA病毒，含有11個分節段的基因片段，共有 6 種結構蛋白(VPl，VP2，VP3，VP4，VP6，VP7)和5 種非結構蛋白(NSPI，NSP2，NSP3，NSP4，NSPS)［2］。其中輪狀病毒VP7蛋白是該病毒的一個重要的結構蛋白，在激發機體體液免疫產生特異性抗體方面發揮極為重要的作用［3］。為此，本研究擬通過原核表達獲得輪狀病毒VP7的重組抗原，將純化的重組抗原免疫產蛋雞，進一步應用水稀釋-鹽析法提取分離高效價含抗VP7的卵黃抗體，為輪狀病毒感染性腹瀉的靶向性藥物研發奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

基因工程菌株E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)，以及原核表達質粒pET28a(+)均為四川理工學院化學制藥實驗室保存。含野生型A組輪狀病毒(診斷為G4血清型)，糞便樣品和對照樣品均由自貢某醫院提供。T4 DNA連接酶購于NEB公司;E×Taq DNA聚合酶、限制性核酸內切酶EcoR I和Xho I等購于TaKaRa公司;DNA片段回收試劑盒和質粒抽提試劑盒購于北京博大泰克公司;HRP標記的兔抗雞IgY、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐購于Sigma公司;Bradford蛋白定量試劑盒購于Bio-rad公司;其余試劑均為國產分析純。含VP7全長序列的模板由北京中科院微生物研究所陳曉英老師提供(來源于A組輪狀病毒株T114)。海藍褐蛋雞，湖北省宜昌市種雞廠購買。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成

參考GenBank中A組輪狀病毒VP7的DNA序列，根據提供的VP7序列設計VP7原核表達引物，在一對引物的5'端加上EcoRI和XhoI酶切位點，VP7擴增引物序列如下(下劃線者為酶切位點):

上游引物:5'-CCGGAATTCTTGCCAATTACTGGATCTAT-3';下游引物:5'-CCGCTCGAGCATTCGTTCTGTTTGTGGA-3'。為保證酶切效率，酶切位點前加上了保護堿基。引物由深圳華大基因公司合成，預期擴增片段長度約為730 bp。

1.2.2 VP7的PCR擴增與原核及真核表達載體構建

取5 ngVP7全長DNA序列作為模板，PCR擴增VP7基因，擴增條件為:變性94℃ 45 s;退火53℃ 35 s;延伸72℃ 1 min，共32個循環，凝膠電泳鑒定。將PCR產物按DNA片段回收試劑盒說明書進行回收，EcoR I和Xho I雙酶切回收產物，與同樣經過雙酶切處理的原核表達載體pET28a(+)進行連接［4］。重組質粒命名為pET28a-VP7，按常規方法酶切及PCR鑒定重組質粒，進行基因測序。

1.2.3 VP7重組蛋白的誘導表達

將鑒定正確的重組質粒pET28a-VP7轉化E.coli BL21(DE3)感受態細胞。將轉化后的菌在LB固體平板培養基(含卡那霉素)過夜培養，次日挑取單菌落接種于3 mL含卡那霉素的LB液體培養基，于37℃，200 rpm振蕩培養;過夜培養后，按1:200接種擴大培養，待菌液OD600值為0.6～0.8時加入終濃度為0.5 mM IPTG 誘導(同時設不加IPTG誘導或空載體相關對照)，6 h后取樣離心收集菌體，SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4 包涵體蛋白的洗滌與復性

確定表達后，擴大菌體培養。離心收集菌體，用PBS重懸洗滌2次，按照菌體﹕裂解液體積比1∶10加入裂解緩沖液(包含溶菌酶濃度為10 mg/mL的PBS溶液)，冰浴1 h，采用3次反復凍融法裂解菌體，12000 rpm離心5 min，收集包涵體沉淀。先用包含0.1%Triton的2 M尿素洗滌包涵體沉淀一次，12000 rpm離心10 min，收集沉淀用2 M尿素洗滌包涵體2次;離心收集沉淀，并用含8 M尿素的0.05 M Tris緩沖液(pH 8.0)按照50∶1包涵體體積比溶解包涵體20 min;12000 rpm離心10 min，收集上清液按照50:1體積比進行尿素梯度透析復性。初始透析液為含5 M尿素的Tris緩沖液(Tris緩沖液配方:pH 8.1，50 mM Tris，0.5 mM EDTA，50 mM NaCL，5%甘油，1%Gly)。然后逐步透析復性:棄1/5體積透析液，加入新的等體積透析液，透析4 h，共透析6次;最后用PBS透析2 h，2次。12000 rpm離心10 min，收集上清液，并應用Bradford法和SDS-PAGE對復性的重組蛋白進行檢測分析。

1.2.5 免疫產蛋雞

使用考馬斯亮藍G-250法測定純化蛋白濃度，適當調節蛋白濃度，初次免疫時使用完全弗氏佐劑與純化VP7重組抗原完全混勻并充分乳化，每只雞免疫量為400 μg。分別于初次免疫后第2、4周加強免疫，加強免疫時使用不完全弗氏佐劑，免疫劑量為250 μg，每次免疫均采用三點肌肉注射免疫。初次免疫一周后每周收集雞蛋一次，4℃保存備用。

1.2.6 卵黃抗體提取

將蛋清與蛋黃分離，將蛋黃上蛋清液去除干凈;按照卵黃﹕超純水為1:7(V/V)比例用超純水稀釋卵黃液，混勻。用冰醋酸調節卵黃稀釋液pH至5.0，4℃靜置6 h或過夜;次日4℃下10000 rpm離心15 min。收集上清液，緩緩加入NaCl(終濃度為8.8%)，調節PH至4，4℃靜置2 h;4℃下10000 rpm離心15 min，收集沉淀;沉淀中加入50 mL 30%(NH4)2SO4重懸，靜置2 h;10000 rpm低溫離心15 min，收集沉淀，用超純水溶解。然后將溶液裝入透析袋用超純水透析8 h，并每2 h換水一次。將透析后的溶液在4℃下10000 rpm離心15 min，收集上清液進行冷凍干燥，即為純化的IgY抗體成品，并按Bradford法進行蛋白定量。

1.2.7 ELISA 分析 IgY 滴度

將純化的VP7重組蛋白用包被液稀釋至1 mg/mL，ELISA板每孔包被100 μL，4℃過夜;PBST洗板3次后加入終濃度為5 mg/mL的BSA溶液，每孔100 μL，室溫封閉2 h;PBST洗板3次后加入不同稀釋倍數的純化IgY(1∶100～1∶200000)，室溫孵育2 h;PBST 洗板4次，加入1∶10000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗雞IgY(100 μL/孔)，37℃孵育2 h;PBST洗板3次，加 TMB(100 μL/孔)顯色，37 ℃避光作用10 min;每孔加入100 μL 4 mol/L H2SO4終止液終止反應;酶標自動分析儀450 nm波長測定其光吸收值(OD450)。實驗中設相應對照，吸光度OD值2倍以上為陽性標準，測定抗體滴度。

1.2.8 SDS-PAGE 分析 IgY 抗體

分別取5 μg的IgY于2個EP管中，分別加入變性和非變性的蛋白電泳上樣緩沖液，通過SDS-PAGE電泳檢測IgY純度;并應用Bradford法對IgY進行蛋白定量分析。

1.2.9 Dot blot點雜交

將含野生型A組輪狀病毒糞便粗提液(診斷為G4血清型)和對照腹瀉糞便粗提液(診斷為非輪狀病毒腹瀉)，用PBS溶液按10倍倍比稀釋粗提液，并用微量加樣器點1 uL于NC膜上，置37℃恒溫箱2 h。5%BSA室溫搖床上封閉2 h，將純化的VP7重組蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，利用蛋白電轉移系統將蛋白轉至NC膜，5%BSA室溫搖床上封閉2 h，加純化的IgY抗體作一抗(1∶1000)，室溫作用2 h或4℃過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，加入1∶10000稀釋的二抗(HRP標記的羊抗雞IgY)，室溫作用90 min，TBST洗滌3次，每次10 min，DAB 顯色。

2 結果

2.1 VP7的PCR擴增及其重組質粒的鑒定

經VP7序列特異性引物PCR擴增后，出現約為0.73 kb片段(圖1)，大小與預期相符。將VP7克隆到pET28a載體上形成重組質粒pET28a-VP7，將重組質?；驕y序，測序結果與預期結果一致。

圖1 VP7基因PCR擴增

2.2 VP7重組蛋白的誘導表達與包涵體處理

將鑒定正確的重組質粒pET28a-VP7轉化E.coli BL21(DE3)，0.5 mM IPTG 誘導，SDS-PAGE 結果表明，特異表達出約33 kD的融合蛋白(圖2A)，大小與預期的融合VP7蛋白相符;且在30℃ ～37℃條件下VP7主要以包涵體形式表達。收集包涵體，通過對包涵體的洗滌和梯度透析復性，包涵體復性回收效率達到90%;將回收的VP7分別經透析粗純化及Ni-柱細純化后能得到純度較高的VP7;經過SDS-PAGE檢測結果表明最后得到了純度較高的VP7重組蛋白(圖2B)。

圖2 VP7重組蛋白的誘導表達和純化

2.3 卵黃抗體(IgY)的提取與純化

按水稀釋法粗提的卵黃抗體IgY，SDS-PAGE電泳發現，所提取的IgY水粗提取液(WSF)中含有大量雜蛋白;WSF再經過(NH4)2SO4鹽析和超濾純化后，其純度提高。在非還原狀態下，IgY分子量為170 kDa左右，電泳結果顯示為一條170 kDa左右的特征性條帶(圖3);在還原狀態下，電泳結果表明在65 kDa及25 kDa處可見清晰的2條特征性條帶，分別是 IgY的重鏈和輕鏈(圖3)。最后定量結果表明，卵黃抗體IgY的產量可達8 mg/mL蛋黃，純度可達90%。

圖3 卵黃抗體(IgY)SDS－PAGE電泳圖

2.4 Anti－VP7 IgY的滴度分析

用間接ELISA方法檢VP7特異性IgY的抗體效價變化規律。如圖4所示，蛋雞初免約1周后蛋黃中可檢測到特異性卵黃抗體，加強免疫后特異性IgY效價呈明顯的增長趨勢，第二次加強免疫后抗體滴度上升達到較高水平，抗體滴度可達1∶100000。并且在兩次加強免疫后IgY能在較長的時間內保持較高的滴度。

圖4 抗VP7卵黃抗體的動態特征

2.5 Dot blot點雜交

以純化的IgY作為一抗分析該卵黃抗體識別和結合病毒的能力。結果如圖5所示，將含病毒粗提液稀釋到100倍時，制備的Anti-VP7 IgY亦能檢測到較強信號，而對照樣品檢測不到信號。表明免疫獲得的IgY抗體具有識別和結合病毒抗原的活性。

圖5 anti－VP7 IgY點雜交結果

3 討論

人A組RV衣殼蛋白VP7是一種能夠結合鈣離子的糖蛋白，通過低鈣作用誘導病毒顆粒從三層同心圓的衣殼蛋白包被向二層同心圓衣殼蛋白包被轉化［5］，與細胞表面的整合素受體 α2β1 和 α4β1 結合，使RV黏附、進入細胞［6］。因此，將 VP7作為藥靶通過其抗體結合抑制RV病毒顆粒轉化和細胞黏附，抑制RV對嬰幼兒小腸絨毛的感染是理想的選擇之一。雖然RV滅活疫苗已在澳大利亞、墨西哥和巴西使用，但后續臨床觀察表明此疫苗與發生腸套疊相關而停止［7］。在發展中國家，可能是區域內嬰幼兒遺傳、免疫發育和身體健康狀況等差異，臨床試驗也未得到理想的效果，RV感染性腹瀉時常反復發生，造成該疫苗在發展中國家和地區難以得到普及，限制了疫苗對RV引起腹瀉的預防［7-10］。

卵黃抗體(IgY)及其雞蛋易獲得、不能激活補體和胃腸道細胞Fc段受體、對人體無毒副作用和可以阻止胃腸道病毒感染的優點，現已成為消化道感染的一種很有前途的候選藥物。相對于常規治療，口服抗RV抗體均能顯著縮短患兒的病程，提高抗RV的能力［11-13］，但是臨床上在國內一直缺乏針對人RV高效價卵黃抗體的應用。目前的抗RV卵黃抗體，均以分離的RV全毒株為免疫原，免疫產蛋雞獲得卵黃抗體，但該抗體效價低(試驗結果待發表)，制備過程需要RV病毒培養、純化和滅活等過程，且制備過程技術要求高、滅活不徹底、散毒和病毒殘存等風險，如葛蘭素史克GSK公司生產的疫苗Rotarix因被檢出動物病毒污染而于2010年被迫暫停使用。相對于已有人A組RV卵黃抗體的制備方法，本文以人A組RV的VP7為靶點，通過基因工程技術實現了VP7重組抗原在基因工程菌中的大量表達，并純化出VP7重組抗原，進而免疫產蛋雞，制備了成本低、滴度高、穩定性好且能特異性識別和結合野生型人A組RV的IgY卵黃抗體，為后期開展輪狀病毒感染性腹瀉的診斷、治療和預防用口服抗體藥物制劑的開發奠定了基礎。

［1］ Vesikari T.Rotavirus vaccination:a concise review［J］.Clin Microbiol Infect，2012，18(5):1-7.

［2］ Patton J T.Structure and function of the rotavirus RNA-binding proteins［J］.J Gen Virol，1995，76(11):2633-2644.

［3］ Pesavento J B，Crawford S E，Estes M K，et al.Rotavirus proteins:structure and assembly［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2006，309:189-219.

［4］姜琳琳，張孝云，馬 莉，等.基因工程抗體抗CD19(Fab)LDM的制備及生物學活性研究［J］.中國藥理學通報，2013，10:1363-1368.

［5］ Ludert J E，Ruiz M C，Hidalgo C，et al.Antibodies to rotavirus outer-capsid glycoprotein VP7 neutralize infectivity by inhibiting virion decapsidation［J］.J Virol，2002，76:6643-6651.

［6］ Zárate S，Romero P，Espinosa R，et al.VP7 Mediates the Interaction of Rotaviruses with Integrin αvβ3 through a Novel Integrin-Binding Site［J］.J Virol，2004，78:10839-10847.

［7］江保明，楊曉明，徐德啟.輪狀病毒疫苗的現狀和發展動向［J］.中國生物制品學雜志，2012(2):251-253.

［8］ Niraj C，Patel M D，Paula M，et al.Vaccine-acquired rotavirus in infants with severe combined immunodeficiency［J］.N Engl J Med，2010，362:314-319.

［9］ Patel M M，Steele D，Gentsch J R，et al.Real-world impact of rotavirus vaccination［J］.Pediatr Infect Dis J，2011，30:1-5.

［10］ Vesikari T.Rotavirus vaccination:a concise review［J］.Clin Microbiol Infect，2012，18(5):57-63.

［11］ Liu Y，Huang P，Tan M，et al.Rotavirus VP8:Phylogeny，host range，and interaction with histo-blood group antigens［J］.JVI，2012，18:9899-9910.

［12］陳六英，黃雄七，胡永紅，等.抗A組輪狀病毒雞卵黃免疫球蛋白的臨床評價［J］.中國實用兒科雜志，1998，13:225-226.

［13］ Rahman S，Higo M K，Htun K W，et al.Randomized placebo-controlled clinical trial of immunoglobulin Y as adjunct to standard supportive therapy for rotavirus-associated diarrhea among pediatric patients［J］.Vaccine，2012，30(31):4661-4669.