異檸檬酸脫氫酶1基因突變焦磷酸測序檢測方法的建立

王丹慧 蔡彥寧 張燕莉 高 杰 楊彩俠

(首都醫科大學宣武醫院神經生物學研究室教育部神經變性病重點實驗室北京市老年病醫療研究中心，北京 100053)

膠質瘤是最常見的原發性顱內腫瘤，其中惡性膠質瘤的發病率為(5～8)/100萬，5年病死率在全身腫瘤中僅次于胰腺癌和肺癌，位列第3位。膠質瘤給社會和家庭造成了巨大負擔，因而一直是腫瘤研究的熱點［1］。

異檸檬酸脫氫酶1(isocitrate dehydrogenase 1，IDH1)是膠質瘤研究領域的重要分子標志物。IDH1是否存在突變和膠質瘤患者的預后、膠質瘤的鑒別診斷以及指導放射治療化學治療密切相關。IDH1突變最早為Parsons等［2］所發現，該研究顯示約12%的多形性膠質母細胞瘤患者存在IDH1第132位精氨酸的突變。在絕大多數攜帶突變的患者中，IDH1第132位精氨酸突變為組氨酸(R132H，CGT→CAT)［3-5］，少數患者突變為半胱氨酸(R132C，CGT→TGT)，或絲氨酸(R132S，CGT→AGT)、甘氨酸(R132G，CGT→GGT)、亮氨酸(R132L，CGT→CTT)、纈氨酸(R132V，CGT→GTT)、脯氨酸(R132P，CGT→CCT)［3，6］。Par-sons等［2］的研究還提示，相同病理級別情況下，IDH1突變患者較野生型患者的預后好。隨后的研究［7-8］進一步揭示IDH1基因突變是膠質瘤獨立的、強大的較野生型IDH1預后好的標志物。有學者［9-11］也對IDH1突變在不同類型膠質瘤中的分布情況展開研究，結果表明，IDH1突變主要出現于低級別膠質瘤和繼發性膠質母細胞瘤中，原發性膠質母細胞瘤、兒童多形性膠質母細胞瘤、毛細胞型星形細胞瘤中IDH1突變率極低。提示對于組織病理學診斷不明確的樣本，可以通過 IDH1基因突變檢測進行輔助鑒別診斷［12］。Wick等［13］報道，新診斷的間變膠質瘤患者可以基于IDH1突變與否選擇放射治療或化學治療。Houillier等［14］的研究進一步顯示，IDH1突變聯合1p-19q缺失的低級別膠質瘤患者，化學治療效果更優。提示IDH1突變對膠質瘤患者的放射治療或化療化學治療方案及生存時間評估具有指導及提示意義。

由于IDH1突變檢測的重要性，多種檢測方法相繼建立。其中，直接測序法是應用最為廣泛的經典檢測手段。近年來，焦磷酸測序法由于能夠檢測低比例突變的存在，也日益受到重視。然而，焦磷酸測序法檢測IDH1突變的靈敏度尚無報道，這也導致鑒別突變存在與否時依賴主觀判斷。此外，通過焦磷酸測序或直接測序分析IDH1突變結果是否存在差異也有待明確。為此，本研究首先構建野生型和突變型IDH1質粒;繼而使用已知比例的混合野生型、突變型IDH1質粒作為模板，分析焦磷酸測序法檢測突變IDH1的靈敏度，明確了判別突變存在與否的客觀標準。最后分別使用焦磷酸測序法和直接測序法分析了96例膠質瘤患者的IDH1基因的突變情況，結果表明焦磷酸測序法能夠更加靈敏地檢測突變。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取首都醫科大學宣武醫院神經外科自2008年3月至2011年6月手術切除并經病理證實的人腦膠質瘤標本96例，經首都醫科大學宣武醫院倫理委員會批準，并獲得患者的知情同意，樣本經石蠟包埋，留后續實驗使用。

1.2 主要試劑與儀器

Chelex(美國 BioRad公司)，蛋白酶 K(上海Sangon公司)，Ex Tag Hot Start Version(日本Takara公司)，PyroMark Gold Q96 Reagents(德國Qiagen公司)，Streptavidin SepharoseTMBeads(美國GE公司)。Nanodrop 2000分光光度計(美國Thermo公司)，PTC-100基因擴增儀(美國MJ research公司)，PyroMark Q96 ID焦磷酸測序儀(德國Qiagen公司)。

1.3 質粒構建及直接測序

由上海生工公司依照IDH1野生型及7種突變型(R132H，R132C，R132S，R132G，R132L，R132V，R132P)序列化學合成8種片段(表1)，插入PUC57質粒載體，獲得相應質粒，送諾賽公司直接測序。

表1 野生型和突變型IDH1基因型序列Tab.1 The sequences of wide-type and mutant-type IDH1 genotypes

1.4 焦磷酸測序檢測質?；蛐?/h3>

將8種質粒進行焦磷酸測序以驗證插入片段序列的準確性及兩種方法檢測的一致性。PCR擴增正向引物序列為5’-GCTTGTGAGTGGATGGGTAAA-3’，反向引物序列為5’-TTGCCAACATGACTTACTTGATC-3’(生物素標記)，擴增產物長度75 bp。PCR反應總體積50 μL，其中正向引物(10 μmol)及反向引物(10 μmol)各 1 μL，25 mmol dNTP 4 μL，10 × Ex Tag Buffer 5 μL，TaKaRa Ex TaqTMHS 0.25 μL，36.75 μL 超純水，模板質粒2 μL(2 000拷貝)。反應條件:94℃預變性2 min;94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，36個循環;最后72℃延伸5 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳確認后進行焦磷酸測序。

焦磷酸測序引物為:5’-GGGTAAAACCTATCATCATA-3’;分析序列:位點1為 GGTNGTCATGCTTAT，位點2為GGTCNTCATGCTTAT;堿基分配順序:CGTGCAGTCAT。測序體系80 μL，96孔板中加入PCR產物15 μL，Streptavidin SepharoseTMBeads 3 μL，PyroMark Binding Buffer 40 μL，超純水22 μL，室溫震蕩混勻。上負壓工作站，依次以70%乙醇、0.2 mol/L NaOH以及1 x Wash Buffer沖洗，以除去非生物素化的DNA片段。在測序板中釋放生物素化的DNA片段，測序板每孔預先加入測序引物S(0.4 μmol/L)40 μL。隨后80 ℃加熱測序板2 min，室溫冷卻5 min，即可上機進行測序。

1.5 膠質瘤樣本基因組DNA提取

取10 μm 蠟塊切片(1.5 cm ×2 cm)5 張，加1 mL二甲苯，65℃恒溫震蕩10 min，10 700 r/min，離心5 min，去上清，重復二甲苯處理3次。加無水乙醇 1 mL，混勻，10 700 r/min，離心 5 min，去上清，以 95%、75% 乙醇各離心沉淀1次?？諝飧稍?，加入200 μL的5%Chelex懸浮沉淀，加入5 μL蛋白酶K(20 mg/mL)，55℃震蕩3 h至溶液澄清。98℃ 10 min滅活蛋白酶K。簡短離心后取上清放入新離心管，加入20.5 μL NaAC(3 mol/L，pH 5.2)，450 μL 無水乙醇，混勻，－20℃冷凍1 h。10 700 r/min，離心5 min，去上清，加70%乙醇1 mL，10 700 r/min，離心 5 min，去上清。干燥，DNA溶解于100 μL TE緩沖液。

1.6 直接測序法檢測膠質瘤樣本IDH1突變

PCR擴增正向引物序列為5’-CGGTCTTCAGAGAAGCCATT-3’，反向引物序列為5’-GCAAAATCACATTATTGCCAAC-3’，擴增產物長度129 bp。PCR反應總體積25 μL，其中正向引物(5 μmol)及反向引物(5 μmol)各 1.25 μL，25 mmol dNTP 2 μL，10 × Ex Tag Buffer 5 μL，TaKaRa Ex TaqTMHS 0.125 μL，15.875 μL 超純水，模版 DNA 2 μL(50 ng)。反應條件:94℃預變性40 s;94℃變性20 s，59℃退火20 s，72℃延伸20 s，36個循環;最后72℃延伸5 min。取PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳確認后送生工公司，使用擴增引物正反向測序。

1.7 焦磷酸測序法檢測膠質瘤樣本IDH1突變

PCR擴增正向引物序列為5’-GCTTGTGAGTGGATGGGTAAA-3’，反向引物序列為5’-TTGCCAACATGACTTACTTGATC-3’(生物素標記)，擴增產物長度75 bp。PCR反應總體積50 μL，其中正向引物(10 μmol)及反向引物(10 μmol)各 1μL，25 mmol dNTP 4 μL，10× Ex Tag Buffer 5 μL，TaKaRa Ex TaqTMHS 0.25 μL，36.75 μL 超純水，模板 DNA 2 μL(50 ng)。反應條件:94℃預變性2 min;94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，36個循環;最后72℃延伸5 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳確認后進行焦磷酸測序。

焦磷酸測序引物為:5’-GGGTAAAACCTATCATCATA-3’;分析序列:位點1為 GGTNGTCATGCTTAT，位點2為 GGTCNTCATGCTTAT;堿基分配順序:CGTGCAGTCAT。測序體系80 μL，96孔板中加入PCR產物 15 μL，Streptavidin SepharoseTMBeads 3 μL，Pyro-Mark Binding Buffer 40 μL，超純水 22 μL，室溫震蕩混勻。上負壓工作站，依次以 70%乙醇、0.2 mol/L NaOH以及1×Wash Buffer沖洗，以除去非生物素化的DNA片段。在測序板中釋放生物素化的DNA片段，測序板每孔預先加入測序引物S(0.4 μmol/L)40 μL。隨后80℃加熱測序板2 min，室溫冷卻5 min，即可上機進行測序。

1.8 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據處理和統計分析，計數資料采用百分數表示，兩種測序方法突變檢出陽性率的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 野生型和突變型IDH1質粒的構建

8種質粒經諾賽測序公司直接測序，驗證插入片段序列正確。

2.2 焦磷酸測序法的建立

使用構建的IDH1質粒為模板，擴增得到75 bp的產物，凝膠電泳顯示擴增產物長度正確(圖1)。使用焦磷酸測序引物對質粒擴增產物進行測序反應，結果與直接測序結果一致(圖2)。

圖1 野生型和突變型IDH1基因擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of wide-type and mutant IDH1

2.3 焦磷酸測序法靈敏度的分析

將攜帶R132H突變的質粒與野生型質粒按照1∶9，1∶19，1∶49，1∶99 混合，其中突變 DNA 分別占總DNA含量的10%，5%，2%，1%。以上述混合DNA為模板，擴增后進行焦磷酸測序，每組實驗重復3次。結果表明焦磷酸測序法3次均成功檢測出占總DNA含量2%的突變。對于占總DNA含量1%的突變，焦磷酸測序法檢測的成功率為66.7%(2/3)(圖3)。使用攜帶其他類型突變的質粒與野生型質?；旌?，檢測焦磷酸測序法的靈敏度，結果同樣顯示突變檢測靈敏度為2%。

圖2 野生型和突變型IDH1基因焦磷酸測序圖Fig.2 Pyrosequencing analysis of wide-type and mutant IDH1

圖3 焦磷酸測序檢測IDH1突變靈敏度分析Fig.3 Sensitivity analysis of pyrosequencing in IDH1 mutation examination

2.4 膠質瘤樣本直接測序和焦磷酸測序的比較

分別使用直接測序法和焦磷酸測序法檢測96例膠質瘤樣本的突變情況。如表2所示，直接測序法僅能檢出兩種形式的突變，突變樣本占樣本總量的32.3%。焦磷酸測序法能夠檢出六種形式的突變，突變樣本占樣本總量的74.0%。兩種方法突變檢出率相比差異有統計學意義(P＜0.05)。

表2 焦磷酸測序法和直接測序法檢測IDH1基因突變的比較Tab.2 Comparison between pyrosequencing and direct sequencing in IDH1 mutations examination

3 討論

目前已經建立多種IDH1突變檢測方法，包括免疫組織化學法、高分辨率熔解曲線法、直接測序法、焦磷酸測序法等［15-16］。免疫組化法檢測依賴特異抗體，由于野生型和突變型IDH1僅存在一個氨基酸的差異，蛋白結構非常相似，從而導致抗體特異性識別的困難。有報道［3］顯示，IDH1-R132H單克隆抗體與R132L蛋白有交叉反應。高分辨率熔解曲線依靠分析DNA片段解鏈溫度的差異辨識突變是否存在。由于一些突變與野生型間解鏈溫度差別不大，難以被檢出。此外，當突變基因占比較小時，其對整體峰型的影響容易被忽視，也會導致誤判［17-18］。直接測序法是應用最為廣泛的IDH1突變檢測方法。然而該方法靈敏度低，突變DNA占總DNA的20%以上方可被檢出。這就帶來了誤診的可能［17-20］。焦磷酸測序法操作簡便，檢測快速，在2～3 h內即可完成，特別適合臨床診斷。而且與直接測序相同，本方法能夠通過一次反應精確判定突變的類型，為免疫組織化學和高分辨率熔解曲線等方法無法比擬。與直接測序相比，焦磷酸測序能夠更加靈敏地檢測出低比例突變的存在，從而能夠彌補腫瘤細胞樣本采集過程中難以避免的腫瘤細胞占比低的不足，對于腫瘤突變相關檢測意義重大。

焦磷酸測序方法正越來越多地用于IDH1突變的檢測，但其檢測靈敏度仍無報道。以往的研究中一般人為設定5%作為判定是否存在突變的標準。本研究表明，焦磷酸測序檢測IDH1突變的靈敏度可以達到2%，甚至更高。為今后判定IDH1突變提供了客觀的參照。本課題組的結果還表明焦磷酸測序法對于患者突變與否的判定與直接測序法間存在明顯差異。依據焦磷酸測序結果對患者進行判定，并跟蹤隨訪將有助于進一步闡明IDH1作為生物標記物對于膠質瘤的意義。同時，焦磷酸測序法還能夠定量分析突變基因所占比例?？梢酝茰y，突變比例的高低很可能對于預后判斷、用藥指導等方面也具有重要的意義，值得進一步研究。

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