和厚樸酚衍生物對肝癌細胞（HepG2）凋亡的影響

仇鯨翔 陳俐娟

（四川大學生物治療國家重點實驗室，四川 成都，610064）

我國常用中藥材厚樸為木蘭科植物厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）或凹葉厚樸的干燥干皮、根皮及枝皮，具有燥濕消痰、下氣除螨之功效，用于食積氣滯，腹脹便秘，痰飲喘咳等?，F代藥理研究表明，厚樸具有影響胃腸活動、抗菌、鎮咳、肌肉松弛和中樞抑制等作用［1］。和厚樸酚（Honokio1）帶有烯丙基的連苯二酚類化合物—是厚樸的主要化學成分。研究人員發現，和厚樸酚表現出多種藥理作用，如抗炎、抗心律失常、抗癲癇［2］、抗血小板聚集等。此外，有研究報道和厚樸酚還可以抑制氮氧化產物和腫瘤壞死因子TNF的產生［2－4］。為了尋找和開發高效、低毒的抗腫瘤活性化合物，我們以和厚樸酚為母體，通過“Mannich反應”對其進行結構修飾，合成了數個和厚樸酚的衍生物，采用MTT法測試了和厚樸酚衍生物對不同腫瘤細胞的毒性作用，并進一步采用細胞流式分析手段研究了和厚樸酚衍生物對肝癌HepG2細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

和厚樸酚（Honokiol）購買于成都科華生物技術公司（純度大于99%），和厚樸酚衍生物本實驗室合成，合成過程參照本實驗室的研究成果，同時略作修改［6］，用純度大于99%的二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成40μM的儲存液備用，其中，DMEM及RPMI 1640培養基，胎牛血清（FBS）等試劑均購自蘭州民海生物公司。四氮唑鹽（MTT）：Sigma公司產品，使用前先用生理鹽水配制成5g／L儲存液，二甲基亞砜（DMSO）：Sigma公司產品，其余普通試劑均為國產的分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 化合物合成

某些酚類化合物可以和一分子甲醛及胺發生Mannich反應。根據實驗室已有的研究結果［5］，我們通過微波促進的Mannich反應對和厚樸酚酚羥基臨位進行修飾，合成了以下1＃H—6＃H衍生物。

1.2.2 細胞培養

HepG2細胞采用實驗室的常規培養方法培養，該細胞于含10%胎牛血清、100U／mL青霉素和100mg／L鏈霉素的DMEM培養液中，置飽和濕度37度的5%CO2培養箱中培養。

1.2.3 MTT試驗

取對數生長期的HepG2細胞單個核細胞，以5×104個細胞／孔的密度接種于96孔板中培養。實驗組設立8個藥物濃度組，每組HNK的終濃度為5、10、15、20、25、30、35、40μg／mL，每個藥物濃度組設8個復孔。對照組加入同樣濃度的二甲基亞砜（DMSO），每個劑量五個平行孔。分別于12、24、48小時取一塊96孔培養板，板中每孔加入新鮮配制的濃度為5mg／mL的MTT 20μL。繼續培養3h后取出培養板，小心吸棄培養基，每孔加DMSO 150 μL，輕輕震蕩10分鐘后，用酶標儀于490nm處測出各孔吸光度值OD，近下式計算細胞抑制率：根據公式：細胞抑制率（%）＝（1－給藥孔平均OD值／對照孔平均OD值）×100%。

圖1 1＃H—6＃H化合物的合成

1.2.4 用流式細胞儀檢測Sub凋亡峰

收集藥物作用后的HepG2細胞，用PBS洗一次，用預冷的70%乙醇于4度固定至少12h。離心后的細胞并用PBS沖洗、再用含50mg／L的PI，l g／L RNAase及0.1%Triton X－100的染料溶液冰浴避光孵育30min后。流式細胞儀分析。激發波長488nm，發射波長630nm。DNA含量少于正常二倍體細胞的亞二倍體細胞比率計為凋亡比率。

1.2.5 統計分析

實驗數據采用Mean±SD表示，檢測的調亡數據比例用SPSS 13.0軟件中的ANOVA進行統計比較，主要檢測各種數據間是否存在差異的顯著性，P值小于0.05視為具有顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 和厚樸酚衍生物抗增殖活性比較

為了比較和厚樸酚衍生物對腫瘤細胞抗增殖活性，我們采用MTT法測定了和厚樸酚及其衍生物對腫瘤細胞 HepG2、K562、SMMC－7221、LO2細胞增殖的影響。結果如表1和圖2所示，從表1中可以看出，和厚樸酚3＃H衍生物的抗性最強，而6種衍生物的抗增殖活性存在劑量依存關系，這些劑量依存關系我們用軟件分析后發現具有較好的劑量與效果的依存線性關系，這些線性關系表明和厚樸酚衍生物能夠較好的抑制腫瘤細胞抗增殖。

表1 6個和厚樸酚衍生物對腫瘤細胞抗增殖活性

圖2 和厚樸酚衍生物抑制HepG2細胞增殖檢測結果

2.2 和厚樸酚衍生物對腫瘤細胞HepG2形態的影響

在顯微鏡下觀察到正常HepG2細胞狀態良好，均勻的貼附于培養板底面，而和厚樸酚衍生物3＃H作用細胞12h后，細胞皺縮，浮起變圓，核周邊出芽，形成很多凋亡小體。

2.3 和厚樸酚衍生物誘導HepG2細胞發生凋亡的比率

在檢測中發現，細胞發生凋亡，DNA斷裂，染色體片段化，為了證明凋亡，并檢測凋亡比率，可用流式細胞儀PI染色法分析。正常HepG2細胞無亞二倍體峰（G0／G1期）（3%），而加入和厚樸酚衍生物3＃H處理后，二倍體峰前面出現明顯的凋亡特征的亞二倍體峰（29.4%）。經統計學檢驗表明與未經處理組有顯著性差異。

3 討論

細胞凋亡（apoptosis）即程序性細胞死亡是一種重要的生物學行為。細胞凋亡的形態學特征表現為細胞皺縮，與周圍的細胞連接消失，胞質凝縮，細胞核固縮，細胞骨架解體，胞膜完整，最終形成膜包裹的凋亡小體，無內容物外溢，不引起炎性反應，凋亡小體可迅速被周圍吞噬細胞吞噬?？鼓[瘤藥物通過抑制腫瘤細胞增殖與促進細胞凋亡來殺傷腫瘤細胞。

在本次實驗中我們發現和厚樸酚衍生物體外抗腫瘤活性通過抑制腫瘤細胞增殖，阻斷細胞周期，誘導細胞凋亡來實現。在這些化合物中和厚樸酚衍生物3＃H體外抗腫瘤活性最強。以前研究報道5－甲?；梢燥@著增加和厚樸酚在K562、SPC－A1和A549上的抗增殖活性［6］。我們結果顯示和厚樸酚衍生物3＃H極大地提高了和厚樸酚的抗增殖活性。在本實驗中我們處理細胞24h后：和厚樸酚處理組只有1＃H這個厚樸酚衍生物的誘發細胞凋亡效果比較差外，其他和厚樸酚衍生物效果比較好。在實驗中我們發現，1＃H既沒有抑制細胞增殖也沒有誘發細胞凋亡；2＃H、4＃H、5＃H和6＃H處理組與對照組相比顯著抑制細胞的增殖，誘發細胞凋亡，細胞核形態出現凋亡特征；3＃H處理組大量的細胞從板底脫落，細胞核出現明顯的凋亡特征：細胞核固縮，染色體凝縮，細胞核變得不規則出現月牙狀。形態學和PI流式結果證實厚樸酚處理后HepG2細胞凋亡率增加。提示厚樸酚在小細胞肺癌治療中具有應用價值。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：235.

［2］Liou，K.，Shen，Y.，Chen，C.，et al.，The anti－inflammatory effect of honokiol on nertrophils：mechanisms in the inhibition of reactive oxygen species production［J］.Eur.J.Pharmacol，2003，475：19－27.

［3］Liou，K.，Lin，S.，Huang，S.，et al.Honokiol ameliorates cerebral infarction from is chemia－reperfusion injury in rats［J］.Planta，Med，2003，69：130－134.

［4］Lin，Y.，Chen，H.，Ko，C.，et al.Differential inhibitory effects of honokiol and magnolo on excitatory amino acid－evoked cation signals and NMDA－induced seizures［J］.Neuropharmacology，2005，24.

［5］Liang Ma，Jinying Chen，Xuewei Wang，et al.Structural Modification of Honokiol，a Biphenyl Occurring in Magnolia officinalis：the Evaluation of Honokiol Analogues as Inhibitors of Angiogenesis and for Their Cytotoxicity and Structure Activity Relationship.J.Med.Chem.2011，54，6469－6481.

［6］Luo YF，Xu YB，Chen LJ，H u J，Peng C，Xie DC，Shi JY，Huan g WC，Xu GB，Peng M，Han J，Li R，Yan g SY，Wei YQ.Sem－i synthesis and an t－i proliferative activity evaluation of novel analogues of Honok iol.Bioorg.Med.Chem.Lett.2009；19：4702－05.