醬油二次沉淀蛋白質的分離、鑒定及氨基酸分析

孫鵬飛1,2,3,4，高獻禮1,2,3，閆爽1,2,3，陸健1,2,3,4*

（1.江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 2141222；3.江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122 4. 宿遷市江南大學產業技術研究院，江蘇 宿遷 223800）

醬油起源于我國，是我國的傳統調味品，已有2500多年的歷史。近年來，我國醬油行業呈現產銷兩旺的景象，醬油年銷售量已經突破600萬噸[1]。在此期間，我國醬油的質量也得到了不斷的提高，但醬油二次沉淀問題仍然未得到較好的解決，是困擾我國醬油行業發展的重要質量問題[2]。醬油在巴氏殺菌后析出的沉淀稱作一次沉淀，其可通過過濾消除，對終產品質量影響不大。醬油在儲存和銷售過程中瓶底出現的沉淀為二次沉淀[3]，其嚴重影響我國醬油的外觀質量，特別是與澄清的日本醬油對比時，這種外觀問題嚴重影響消費者的購買傾向。目前，日本醬油的價格是我國醬油的8～10倍，但仍壟斷了歐美市場并對國內的高端市場造成了較大沖擊，其中，我國醬油的二次沉淀問題是導致兩者價格差異較大和我國醬油在高端市場缺乏競爭力的重要原因之一[4]。

目前，國內學者和本實驗的前期工作主要研究了醬油二次沉淀的主要成分、影響其形成的因素及我國醬油二次沉淀含量的分布[2-6]。日本學者對引起醬油二次沉淀的促進因子和引起醬油熱凝集作用的酶分別進行了分離和鑒定[7-9]。由以上研究可知，目前國內外對二次沉淀的研究尚停留在常規指標分析和影響其形成因素的分析上，而對組成醬油二次沉淀蛋白質的質量分布、蛋白質來源及蛋白質氨基酸組成特征等信息的研究尚未見報道。

蛋白質被認為是引起醬油二次沉淀形成的關鍵因素，而深入了解醬油二次沉淀蛋白質的來源和氨基酸組成特征對解決醬油二次沉淀問題尤為重要[3-6]。因此本實驗通過N-三(羥甲基)甘氨酸-十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tricine-SDS-PAGE）和高效液相色譜（HPLC）技術對醬油二次沉淀中的主要成分蛋白質進行分析，并通過基質輔助激光解析電離飛行時間串聯質譜（MALDI-TOF/TOF MS）技術追溯蛋白質的來源，以期對其中蛋白質有更深入的認識，為醬油二次沉淀問題的解決提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醬油 購于江蘇無錫華潤萬家超市，主要釀造原料為脫脂大豆、小麥、食鹽，高鹽稀態釀造，氨基酸態氮≥0.4g/100mL，食品添加劑有焦糖色、谷氨酸鈉、苯甲酸鈉、對羥基苯甲酸乙酯、黃原膠，產地北京，生產日期為 2012.5.31；Tricine和蛋白質標準品（分子量 4.1 ku-45.0ku） 上海生工生物工程公司；NH4HCO3、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、三氟乙酸（TFA） 美國Sigma公司；其他試劑 均為分析純。

垂直電泳儀 美國Bio-Rad公司；Ultraflextreme飛行時間串聯質譜儀 德國Bruker公司；Agilent 1100型氨基酸專用高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；H1850R型臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；QT漩渦混合器 上海琪特分析儀器有限公司；JD-801凝膠成像儀 江蘇省捷達科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 二次沉淀收集 醬油二次沉淀制備方法采用靜置和冷凍干燥法[2-3]，將醬油（500mL，玻璃瓶裝）靜置10d，虹吸法抽去上清，留下最后約20mL醬油和沉淀，搖勻后在4500r/min的條件下離心30min，獲得醬油上清S1以及二次沉淀P1，P1經過冷凍干燥3d后便獲得粉狀沉淀P2（收集量約為0.75g/ L）。

1.2.2 醬油上清蛋白質收集 將收集過沉淀的醬油上清液S1與20%的三氯乙酸（TCA）溶液1:1混合，在冰浴條件下沉降1h，混合物在10000r/min的條件下離心10min，棄上清，獲得上清蛋白質S2。

1.2.3 凝膠電泳分析 將二次沉淀P2和上清蛋白質S2復溶于溶劑中（含8mol/L尿素、1%SDS、1%β-巰基乙醇、0.05mmol/L Tris），在漩渦振蕩器上混合均勻后，10000r/min離心5min，取上清用于電泳。

Tricine-SDS-PAGE分析 由于成品醬油中多肽多在10ku以下[10]，本研究采用了可以分析小于10ku多肽的Tricine-SDS-PAGE凝膠系統，參照曹佐武[11]改良的實驗方法，濃縮膠濃度5%，分離膠濃度16%，陽極緩沖液Tris 12.11g定容至500mL，6mol/L HCl調pH至8.9，陰極緩沖液Tris 6.06g、Tricine 8.96g、SDS 0.5g定容至500mL，樣品上樣量均為15μL，30V電泳半小時，100V電泳至結束。凝膠在含有50%乙醇和10%冰醋酸的固定液中固定半小時后，在考馬斯亮藍R-250染色液中染色3h，然后用含10%甲醇和10%冰醋酸的脫色液脫色至背景清晰，電泳圖譜用JD-801凝膠成像儀記錄，通過捷達801圖像分析軟件3.3分析。

1.2.4 MALDI-TOF/TOF MS鑒定 將凝膠上蛋白質條帶使用自制切點器切下，裝于1.5mL進口EP管中，經脫色、脫水后用胰蛋白酶進行酶解，酶解液經抽提濃縮后，在Anchorchip靶板上進行點靶，待樣品完全干燥后，將靶板放入儀器 Ultraflextreme MALDI-TOF MS/MS（Bruker）進行質譜數據的采集，使用肽段標準品（peptidecalibstandard II）進行校正，數據結果使用Bio Tools軟件整合。搜索參數為：物種屬為全物種；數據庫NCBI；切割酶為胰酶；允許最大漏切位點為1，Mascot分值大于55即為鑒定成功。

1.2.5 氨基酸分析

1.2.5.1 游離氨基酸測定

醬油上清S1以及二次沉淀P2用TCA（濃度5%）靜置沉淀1 h后用雙層定性濾紙過濾，濾液經10000r/min離心10min，取上清液，利用高效液相色譜法測定游離氨基酸的含量。采用HYPERSIL OSD色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），柱溫40℃，紫外檢測器波長338nm，洗脫流速1.0mL/min。

1.2.5.2 總氨基酸測定

醬油上清S1以及二次沉淀P2經過110℃水解22h，水解液經過過濾蒸酸等步驟后用高效液相色譜法測定氨基酸組成。高效液相色譜測定條件同游離氨基酸測定條件。

1.2.5.3 氨基酸疏水性分析

根據Lozano[12]的經驗公式考察氨基酸的疏水性：

Xi表示各氨基酸摩爾百分含量，HΦi表示各氨基酸的疏水值。

1.2.6 數據分析 所有實驗數據均測定3次，取其平均值。運用SPSS 11.5 軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 電泳分析

圖1為樣品的Tricine-SDS-PAGE圖譜，醬油上清S2主要有兩條條帶c和d，條帶c經軟件計算分子量為22.9ku，經積分光密度計算所占百分比為1.65%，d處條帶連成一片，分子量約從2.0ku至14.0ku，可能是大豆蛋白質在醬油釀造過程中被蛋白酶切割成了分子量連續的多肽，所以電泳條帶出現了連片的情況。條帶d經積分光密度計算，占比例為98.35%，是S2中蛋白質的最重要組成部分。醬油沉淀P2主要有兩條條帶a和b，經軟件計算分子量分別約為34.1ku和22.7ku，經積分光密度計算，兩者分別占P2蛋白質的19.80%和80.20%。由以上分析可知，S2中主要的蛋白質是分子量從2.0ku到14.0ku的多肽；而P2中主要的蛋白質是一種分子量約為22.7ku的蛋白質，在S2中同樣發現了一種分子量約為22.9ku的蛋白質，兩者是否為同一種蛋白質需進行MALDI-TOF/TOF MS鑒定 。

圖1 Tricien-SDS-PAGE圖譜Fig. 1 Tricine-SDS-PAGE electrophoresis of the samples

2.2 MALDI-TOF/TOF MS鑒定

為了鑒定沉淀中蛋白質的來源及上清蛋白質是否與醬油二次沉淀蛋白質同源（條帶 b和條帶c），在圖1中取點a、b、c、d進行 MALDI-TOF/TOF MS鑒定。條帶a可信度最高的鑒定結果為大豆球蛋白（Glycinin） G1亞基，Mascot分值155，條帶b和c可信度最高鑒定的結果為大豆球蛋白（Glycinin） G4亞基，Mascot分值分別為254和76，條帶d未鑒定成功。大豆蛋白質主要含有7S和11S兩個亞基，Glycinin是指11S 球蛋白（Globulin），Glycinin 中目前主要鑒定出的亞基有 G1（A1aB1b）、G2（A2B1a）、G3（A1bB2）、G4（A5A4B3）和G5（A3B4），每個亞基含有一個分子量大約在32ku左右的酸性端以及一個分子量在20ku左右的堿性端[13]。條帶 a的分子量與 Glycinin亞基酸性端相吻合，條帶 b和 c分子量與Glycinin亞基堿性端分子量相吻合。袁德保[14]曾測定了Glycinin各酸性端與堿性端的疏水性除了在其等電點下，大小依次為A4

醬油在經過巴氏消毒過濾等步驟出廠，澄清的醬油在貨架上隨時間逐步產生沉淀，沉淀并非一步形成的。由圖1以及MALDI-TOF/TOF MS鑒定結果分析可得，P2中的蛋白質b是上清中的蛋白質c逐步沉降而來，即上清中的蛋白質c是沉淀蛋白質的主要來源。P2中蛋白質a應該也可以在S2中找到，可能因為其在S2中豐度太低而沒有跑出可見條帶。在圖1中，雖然S2中的主要蛋白質都在條帶d中，占了98.35%，但在沉淀P2中幾乎找不到明顯的對應條帶，這說明被蛋白酶切割得到的多肽溶解性較好，不易沉淀。

2.3 氨基酸分析結果

表1是醬油上清S1和二次沉淀P2的氨基酸組成測定結果，蛋白質氨基酸定義為總氨基酸減去游離氨基酸[15]（總氨基酸與游離氨基酸未在表中列出）。疏水值一欄數值越高疏水性越大。

在醬油上清S1和二次沉淀P2中，氨基酸摩爾百分比最高的均為谷氨酸，其次是絲氨酸、天冬氨酸和甘氨酸，這與袁德寶[14]測定的大豆蛋白質中各氨基酸含量的趨勢基本相符。但這幾種氨基酸在S1中所占比例分別比在P2中高45.03%、113.82%、11.98%和25.81%，它們的疏水值均等于小于0.00，是4種親水性氨基酸。而疏水值大于等于1.00的氨基酸在P2中的比例則普遍高于S1，說明二次沉淀蛋白質中疏水性氨基酸比例高。值得注意的是，疏水值較高的脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸在S1中幾乎檢測不到，而在P2中卻占有一定的比重。根據Lozano[12]經驗公式計算的P2的平均疏水值為0.71，而S2的平均疏水值僅0.33，前者比后者高115.15%，方差分析顯示兩類蛋白質的平均疏水值存在顯著性差異（p < 0.05）。上述分析結果與P2中的蛋白質是來源于醬油二次沉淀（不溶性蛋白質），S1中的蛋白質是來源于醬油上清液（水溶性蛋白質）的現象相吻合。同時也說明大豆蛋白質（或多肽）中部分蛋白質（或多肽）的高疏水性是導致其形成醬油二次沉淀的重要原因。

表1 氨基酸組成測定結果Table 1 Amino acid compostion analysis of sample

3 結論

通過以上分析，主要得出以下結論：

3.1 醬油二次沉淀中的蛋白質分別是來源于大豆球蛋白質G4亞基堿性端B3和G1亞基酸性端A1a，兩者分別占醬油二次沉淀蛋白質的80.20%和19.80%。堿性端B3和酸性段A1a是11S大豆球蛋白的重要組成部分，而11S大豆球蛋白是大豆中最重要的蛋白質來源。

3.2 醬油二次沉淀蛋白質氨基酸組成與醬油上清蛋白質相比存在明顯差異，其蛋白質平均疏水值顯著高于后者，這是醬油二次沉淀蛋白質氨基酸組成的主要特征，也是醬油二次沉淀蛋白質形成的重要原因。

因此，如果通過某種方式去除或者降解醬油中Glycinin G4亞基堿性端B3和G1亞基酸性端A1a，可有效解決醬油二次沉淀問題，這需要進一步的研究來證實。

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