阿霉素耐藥的乳腺癌MCF-7/Adm細胞系的建立及其耐藥特性

鄭婷婷，潘姝花，鄭旭升，吳登偉，許傳蓮

（浙江理工大學生命科學院，杭州310018）

阿霉素耐藥的乳腺癌MCF-7/Adm細胞系的建立及其耐藥特性

鄭婷婷，潘姝花，鄭旭升，吳登偉，許傳蓮

（浙江理工大學生命科學院，杭州310018）

建立腫瘤耐藥細胞系是研究腫瘤細胞的重要手段之一，也是探討腫瘤多藥耐藥機制及其逆轉的基礎。采用大劑量間歇誘導法誘導MCF-7細胞，建立MCF-7/Adm耐藥模型；MTT法檢測耐藥倍數；流式細胞術檢測MCF-7細胞和MCF-7/Adm細胞中阿霉素的積累量；real-time PCR檢測MCF-7/Adm細胞中ABCG2、ABCC1、ABCB1基因的表達。結果顯示，阿霉素抑制MCF-7和MCF-7/Adm細胞存活的IC50值分別為0.535μg/mL和173.275μg/mL，耐藥倍數為324；MCF-7細胞中的阿霉素積累量較MCF-7/Adm明顯高；MCF-7/Adm細胞中mRNA水平ABCB1基因表達明顯上調，ABCG2和ABCC1基因表達下調。成功獲得對阿霉素耐藥的人乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/Adm，為進一步研究乳腺癌多藥耐藥機制及其逆轉提供有利工具，并且對乳腺癌化療藥物的篩選具有一定的意義。

阿霉素；乳腺癌；耐藥；ABCB1

0 引 言

乳腺癌是女性多發的惡性腫瘤之一，對婦女的身心健康造成嚴重威脅。據統計，世界范圍內每年新增患者約200萬人，死亡率呈逐年上升趨勢［1-2］。目前，乳腺癌的治療中，化療占有十分重要的地位，尤其是對于癌細胞已經擴散的患者，化療是主要的治療方法。然而隨著化療藥物使用時間的增長，化療藥物對腫瘤細胞的殺死作用逐漸減小，同時也會表現出對不同結構和作用機理的藥物產生交叉耐受性，這種現象稱為多要耐藥性（multidrug resistance，MDR）［3］。腫瘤細胞對化療藥物產生交叉耐藥是化療成功的主要障礙，對腫瘤的治療極為不利，也是困擾著腫瘤學家和癌癥患者的一個重大問題。MDR發生機制比較復雜，但目前ABC轉運蛋白（the ATP-Binding Cassette Transporters）被認為是導致MDR的主要機制之一，其在腫瘤多藥耐藥產生中的主要作用是將化療藥物由腫瘤細胞內泵至細胞外，降低細胞內藥物濃度，從而導致MDR的產生［4］，其中與臨床腫瘤治療關系最密切的是ABCB1、ABCC1、ABCG2。建立耐藥細胞系是研究腫瘤細胞的重要手段，對腫瘤的治療具有十分重要的意義，是探討惡性腫瘤多藥耐藥機制及其逆轉多藥耐藥性的基礎。本研究采用大劑量間歇誘導法誘導MCF-7細胞，建立阿霉素耐藥的人乳腺癌MCF-7細胞系，并檢測耐藥模型較親本株的耐藥倍數，細胞內藥物的積累量等參數，以及多藥耐藥的標志基因ABCB1、ABCC1、ABCG2的表達變化，為深入研究腫瘤耐藥及多藥耐藥逆轉提供理想的模型和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株、藥物與主要試劑

人乳腺癌MCF-7細胞系購于中國科學院上海細胞生物所，1640培養液購于康寧公司，胎牛血清購于Thermo公司，0.25%胰酶購于碧云天公司，噻唑藍（3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（Dimeth-yl sulfoxide，DMSO）購于sigma公司，阿霉素（Adriamycin，ADR）購于生工生物公司。

1.2 MCF-7細胞株的培養

用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的1 640培養液在37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中培養，以0.25%胰蛋白酶消化，3～5 d傳代1次，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.3 耐藥人乳腺癌細胞模型MCF-7/Adm的建立

采用大劑量間歇誘導MCF-7細胞［5］。①取對數期生長的MCF-7細胞按8×103個/孔接種于96孔板，每孔加190μL細胞懸液，培養24 h后，加入終濃度為0.02、0.1、0.5、2.5、12.5μg/mL的阿霉素10μL/孔，設3個復孔；37℃、5%CO2條件下培養48 h；加入5 mg/mL的MTT 10μL繼續培養4 h，棄去培養上清，每孔加入DMSO 150μL搖床上搖10 min，測定各孔的OD570值，計算阿霉素對MCF-7/細胞增殖的抑制率及IC50。其計算公式為：

細胞生長抑制率/%=［1-（實驗組OD值-調零組OD值）/（對照組OD值-調零組OD值）］× 100。

②取MCF-7細胞接種于6㎝培養皿中，37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中培養，進入對數生長期后加入終濃度為0.6μg/mL（＞IC50）的阿霉素，作用12 h，棄含藥培養液換不含阿霉素的培養液培養數代，待細胞生長狀態良好以后，按上述方法重復，直至細胞能維持在0.6μg/mL阿霉素濃度下長期培養即成為耐藥人乳腺癌細胞模型MCF-7/Adm。

1.4 MTT法檢測MCF-7/Adm細胞系的耐藥指數

取對數期生長的MCF-7細胞，調整細胞密度，按每孔8×103個細胞接種于96孔板中，每孔加190 μL細胞懸液，培養24 h后，加入不同濃度的ADR，其終濃度分別為0、1、5、25、125、250μg/mL，每孔總體積200μL；設對照孔為不加藥物的；調零孔為不加細胞的培養液，每組設3個復孔。置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養箱中繼續培養48 h，各孔加入MTT（5 mg/mL）10μL，繼續培養4 h，棄去培養上清，每孔加入DMSO 150μL搖床上搖10 min，測定各孔OD570值，計算阿霉素對MCF-7/Adm細胞增殖的抑制率及IC50值、耐藥指數。其計算公式為：

耐藥指數（RI）=耐藥細胞IC50/野生型細胞IC50。

1.5 流式細胞術測定細胞內藥物的積累量

取生長狀態良好的對數生長期MCF-7細胞、MCF-7/Adm細胞，分別以1×105個細胞接種于6 cm培養皿中，加RPMI 1 640培養液培養24 h后，在培養液中加入阿霉素至終濃度為5μg/mL，培養24 h后，0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，冷PBS洗滌2次，在重懸于冷PBS中，上流式細胞儀檢測（激發波長488 nm，反射波長575 nm）。

1.6 實時熒光定量PCR檢測MCF-7/Adm細胞中ABCG2、ABCC1、ABCB1基因的表達

取對數生長期的MCF-7細胞、MCF-7/Adm細胞，分別以1×105個細胞接種于6㎝培養皿中，加RPMI 1640培養液培養72 h后，收集細胞。Trizol法提取總RNA，檢測其濃度和純度。經過逆轉錄分別得到其cDNA，用于Real-time PCR擴增。引物如表1所示，PCR體系的總體積為20μL，其中包括dd H20 6.4μL，上下游引物分別0.8μL，已稀釋的cDNA2μL，SYRB 10μL，置于實時定量PCR儀設置反應程序并進行PCR反應。設置反應條件為：預變性95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，40個循環后收集熒光。采用2-ΔΔCt法分析數據。

表1 基因的引物序列及其擴增產物大小

1.6 統計學處理

使用SPSS 17.0軟件統計分析，采用t檢驗、方差分析，資料以均數±標準差表示。

2 結 果

2.1 大劑量間歇誘導出MCF-7/Adm細胞

通過終濃度為0.6μg/mL的阿霉素反復間歇誘導，歷時8個月成功誘導出MCF-7/Adm細胞。凍存復蘇后細胞仍能穩定生長、增殖。如圖1，與野生型MCF-7細胞比較，耐藥細胞株MCF-7/Adm的形態發生明顯變化，邊緣不再呈尖角梭型，相對比較圓滑。野生型MCF-7細胞之間接觸比較緊密，而耐藥細胞株MCF-7/Adm之間間隙比較大，排列比較松散。在培養過程中發現，耐藥細胞株MCF-7/ Adm消化時間較野生型稍長。

圖1 MCF-7細胞及MCF-7/Adm細胞的形態觀察（×200）

2.2 ADM對MCF-7和MCF-7/Adm細胞毒性作用及耐藥指數的檢測

不同濃度的ADM作用于MCF-7和MCF-7/ Adm細胞48 h后，如圖2所示，ADM對MCF-7和MCF-7/Adm細胞的抑制率都隨著ADM濃度的升高而增大，但ADM對MCF-7細胞的抑制作用明顯比MCF-7/Adm的強，0.02μg/mL的ADM已經對MCF-7細胞產生抑制作用，但ADM濃度增加為50倍即1μg/mL時，對MCF-7/Adm未見明顯抑制作用。與MCF-7細胞相比，MCF-7/Adm細胞對ADM有明顯的耐藥性（表2），MCF-7/Adm細胞的耐藥指數RI為324倍（P＜0.01）。

圖2 阿霉素對MCF-7和MCF-7/Adm細胞增殖抑制作用（48 h）

表2 MCF-7和MCF-7/Adm細胞對阿霉素的敏感性

2.3 MCF-7和MCF-7/Adm細胞內阿霉素藥物蓄積量的測定

用終濃度為5μg/mL的ADM處理MCF-7細胞和MCF-7/Adm細胞24 h后，流式細胞術檢測MCF-7和MCF-7/Adm細胞內阿霉素熒光強度，結果如圖3顯示MCF-7細胞內ADM的熒光強度明顯比MCF-7/Adm高，分別為98.6%和51.4%。說明MCF-7/Adm細胞內的阿霉素蓄積量明顯低于MCF-7細胞，進一步說明MCF-7/Adm細胞較MCF-7細胞對阿霉素產生耐藥性。

圖3 MCF-7和MCF-7/Adm細胞內阿霉素熒光強度

2.4 Real-time PCR檢測MCF-7/Adm細胞中多藥耐藥的標志基因ABCG2、ABCC1、ABCB1的表達

Real-time PCR結果顯示，與敏感細胞株MCF-7相比，MCF-7/Adm細胞內ABCG2、ABCB1和ABCC1基因的表達有明顯差異，如圖4，ABCG2和ABCC1在耐藥細胞中表達水平下調，而ABCB1在耐藥細胞中表達水平上調。

圖4 MCF-7和MCF-7/Adm細胞內基因ABCG2、ABCC1、ABCB1的表達

3 討 論

目前腫瘤的多藥耐藥性仍被視為化療中的最大障礙。各種腫瘤細胞獲得耐藥性的機制，都可能成為今后化療的靶點［6］。因此，深入研究腫瘤細胞耐藥性機制的產生，尋找關鍵的靶點，進而針對靶點設計逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性的藥物，為降低癌癥死亡率和提高治愈率增加希望［7］。

腫瘤耐藥細胞株的建立是研究MDR發生機制和逆轉策略的重要手段?？梢哉f，目前已知的MDR機制幾乎都首先在耐藥細胞株中發現，而后在臨床病人中得到證實的［8］。國內外學者們用藥物遞增誘導法建立了多種耐藥腫瘤細胞株，以深入研究腫瘤耐藥的機制。體外建立耐藥細胞株作為研究腫瘤細胞MDR機制的重要工具至今已有20多年的歷史，已產生多種誘導耐藥，建立耐藥細胞系的方法［5，8-9］。阿霉素（adriamycin，ADM）是目前臨床上應用較為廣泛的抗腫瘤藥物，抗瘤譜較廣，主要適用于急性白血病，對急性淋巴細胞白血病及粒細胞白血病、乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌等都有一定療效［10］。它是一種蒽環類抗生素，主要是通過進入細胞核固定在拓撲異構酶Ⅱα-DNA復合體上，影響細胞增值，達到殺傷腫瘤細胞的目的，對各種生長周期的腫瘤細胞都有一定的殺傷作用［11］。研究表明，腫瘤化療過程中長期使用阿霉素會導致腫瘤細胞對其產生耐藥性，而且已經有很多阿霉素耐藥細胞株構建成功的例子，所以本課題用阿霉素誘導乳腺癌細胞MCF-7，建立可靠的腫瘤細胞多藥耐藥性模型。

本研究所采用的大劑量間歇誘導法與臨床周期性化療相似，更好地模擬臨床上化療患者出現的耐藥現象，它對腫瘤多藥耐藥性的研究更有意義。經過此方法成功誘導得到MCF-7/Adm耐藥株，其耐藥指數為324。其細胞形態較野生型MCF-7細胞發生明顯變化，而且在培養過程中也發現耐藥株生長也相對緩慢，胰酶消化時間也較野生型稍長。MTT結果提示兩株細胞對ADM的敏感性存在著顯著的差異（P＜0.01）。0.02μg/mL的ADM已經對MCF-7細胞產生抑制作用，但ADM濃度增加為50倍即1μg/mL時，對MCF-7/Adm未見明顯抑制作用，提示MCF-7/Adm細胞對ADM產生了顯著的耐藥性。流式細胞術檢測結果顯示耐藥株內阿霉素濃度明顯降低，這進一步說明耐藥細胞株構建成功。Real-time PCR結果顯示耐藥細胞內ABCB1基因表達上調，而ABCC1基因和ABCG2基因表達下調。初步推斷其產生耐藥性與ABCB1基因表達上調有關，ABCB1導致腫瘤多藥耐藥主要是將化療藥物由腫瘤細胞內泵至細胞外，降低細胞內藥物濃度，從而導致MDR的產生［12］。至于另外兩種耐藥相關基因表達下調的原因尚不清楚，尚需進一步研究?？紤]到腫瘤多藥耐藥的分子機制非常復雜，是基因突變、相關蛋白的表達、各種酶介導、干細胞靶點表達缺失等多因素，多步驟綜合作用的結果［13］，需進一步深入研究。

總之，本研究成功建立了一種人乳腺癌耐阿霉素的細胞株MCF-7/Adm，為進一步研究乳腺癌多藥耐藥性的機制及耐藥性逆轉的藥物提供有利工具，并且對抗乳腺癌化療藥物的篩選具有重要的意義。

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EstabIishment of Adriamycin-Resistant Breast Cancer Mcf-7/Adm CeII Line and the Drug Resistance Feature

ZHENG Ting-ting，PAN Shu-hua，ZHENG Xu-sheng，WU Deng-wei，XUChuan-lian
（School of Life Science，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

Establishment of tumor drug-resistant cell lines is an important method to study tumor cells and is also the foundation of exploring tumor multidrug-resistant mechanism and the reverse.This paper adopted high-dose intermittent deduction method to induce MCF-7 cells and establish MCF-7/Adm drug-resistance model.MTT method is used to detect the drug-resistance times.Flow cytometry is used to detect the accumulation of adriamycin in MCF-7 cell and MCF-7/Adm cell.Real-time PCR was adopted to detect the genetic expression of ABCB1，ABCC1 and ABCG2 in MCF-7/Adm cell.The results show IC50values of MCF-7 and MCF-7/Adm cells restrained by adriamycin are 0.535 and 173.275μg/mL respectively，with drug-resistance times of 324；adriamycin accumulation in MCF-7 cells was significantly higher than that in MCF-7/Adm cells；genetic expression of ABCB1 in MCF-7/Adm cells at mRNA level up-regulated obviously；genetic expression of ABCC1 and ABCG2 down-regulated.This paper successfully gains adriamycin-resistant breast cancer drug-resistance cell strain MCF-7/Adm which provides a helpful tool for studying breast cancer multidrug resistance mechanism and the reverse.It is also significant to choose effective anti-caner drugs.

adriamycin；breast cancer；drug resistance；ABCB1

R737.9

A

（責任編輯：許惠兒）

1673-3851（2014）02-0216-05

2013-10-21

鄭婷婷（1987-）女，山西大同人，碩士研究生，主要從事抗腫瘤天然藥物方面的研究。