新型固定化乙酰膽堿酯酶傳感器的制備及氨基甲酸酯農殘檢測

伍周玲，梁東軍，郭 明，王曉萌，范文翔

（1.塔里木大學 生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.浙江農林大學 理學院，浙江 臨安 311300）

氨基甲酸酯類殺蟲劑殺蟲活性高，在工農業中被廣泛應用，由此帶來的農殘問題已成為影響人類健康與環境安全的重大隱患。目前，常用于農殘檢測的手段主要有液相色譜、氣相色譜、質譜、薄層色譜和氣質聯用等方法[1－5]。這些方法預處理繁瑣[2－6]，檢測周期長，儀器昂貴，尚不能滿足現場檢測的要求，因此，建立快速可靠靈敏的新型分析方法日益重要，電化學生物傳感器由于在農殘檢測中具有諸多優點，已成為農殘檢測分析領域的研究熱點[7－10]，其基本原理是傳感器上的酶與底物相互作用后，生成具有電化學活性的物質，產生氧化還原峰，當酶受到農藥抑制時，峰電流會相應減少[11]，進而通過峰電流的降低值來判斷農藥對酶的抑制程度，完成農藥的定量檢測[12]。多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，CNTs）因它在酶活性中心和電極表面的高速電子轉移能力而被用于酶生物傳感器中電子轉移的 “導線”，該類生物傳感器已被廣泛報道[13－14]。多壁碳納米管在溶液中極易發生團聚[15]，而將多壁碳納米管用強氧化劑進行功能化處理，能夠有效地阻止多壁碳納米管發生團聚，使多壁碳納米管很好地分散在溶液中，形成均一、穩定的分散液[12，14]，將其用于修飾電極，預期可以制備多用途的生物傳感器[17]。在電化學生物傳感器的構建過程中，酶在電極上的固定是關鍵。目前，使用的方法有吸附法、包埋法、共價鍵合法、交聯法、溶膠-凝膠法及電聚合法等[18－20]，這些方法將酶直接修飾于電極表面，酶層容易脫落，傳感器穩定性差。雙醛纖維素（dialdehyde cellulose，DAC）作為纖維素的衍生物之一，其分子結構上的羥基容易與極性官能基團形成氫鍵，使其具有較強的吸附能力，同時其分子結構中的醛基可以與酶分子中的氨基通過共價鍵聯生成Schiff堿化合物[21－22]，能使酶穩定地固定于載體上，是一種極具前景的固定化酶載體材料。本研究將新型材料與新型方法結合，將游離酶通過化學鍵聯技術固定在載體上制成固定化酶，再通過自組裝法制備多層殼聚糖/固定化乙酰膽堿酯酶/功能化碳納米管電化學生物傳感器（Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE）。與現有常規方法相比，該方法吸附酶量大，酶層不易脫落，傳感器性能穩定，線性范圍寬，靈敏度高，可為氨基甲酸酯類殺蟲劑檢測提供快速靈敏的方法，具有一定的新意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660C電化學工作站（上海辰華儀器有限公司，中國）；三電極系統：修飾的CHI104玻碳電極(glassy carbon electrode，GCE，直徑3 mm）作為工作電極，飽和甘汞電極（saturated calomel electrode，SCE）作為參比電極，鉑電極作為對電極；SK3210HP超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司，中國）；電子分析天平（Sartorius公司，德國）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南鞏義予華儀器設備有限公司，中國）；DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司，中國）。

雙醛纖維素（DAC，水熱合成法合成）；1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯（CAB，純度＞99.6%，上海市農藥研究所），乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE，220 mol·s－1·g－1，上海源葉生物科技有限公司），碘化乙酰硫代膽堿（acetylthiocholine iodid，ATCh，純度＞98%，阿拉丁公司）；多壁碳納米管（CNTs，純度＞95%，中國科學院成都化學有限公司）；殼聚糖（Chi，脫乙酰度≥90%，國藥集團化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純；實驗用水為雙蒸蒸餾水。

1.2 多壁碳納米管的功能化

取10.0 mg多壁碳納米管置于50.0 mL濃鹽酸中，磁力攪拌下加熱回流7.0 h，以去除金屬催化劑。純化后的多壁碳納米管置于80.0 mL酸液[V（硝酸）∶V（硫酸）=1∶3]中，室溫下超聲反應10.0 h。蒸餾水洗至中性，得到羧基化的多壁碳納米管（functional carbon nanotubes,F-CNTs）[12]，干燥成粉末，取10.0 mg羧基化的多壁碳納米管溶于N,N-二甲基甲酰胺中，超聲20 min使其分散均勻備用。

1.3 固載酶的制備

磷酸鹽緩沖液中，28℃溫度下雙醛纖維素與乙酰膽堿酯酶磁力攪拌反應2.5 h后取出分離，蒸餾水洗滌至無游離酶，抽濾干燥，制成固定化乙酰膽堿酯酶懸濁液（DAC-AChE），4℃冰箱中保存備用。

1.4 AChE傳感器的制備及表征

玻碳電極分別用0.30和0.05 μm的氧化鋁粉末在拋光布上進行拋光，大量二次蒸餾水沖洗，后將玻碳電極移入超聲清洗儀中依次用二次蒸餾水、無水乙醇、二次蒸餾水超聲清洗（5 min·次－1），室溫晾干。取5.0 μL羧基化的多壁碳納米管（F-CNTs）溶液滴涂至預處理好的玻碳電極表面，晾干后再滴涂5.0 μL固定化乙酰膽堿酯酶（DAC-AChE），自然干燥，最后滴涂5.0 μL殼聚糖溶液（Chi，5.0 g·L－1），制成Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE傳感器，4℃冰箱中保存。同條件下制備Chi/DAC-AChE/GCE，Chi/DAC/FCNTs/GCE修飾電極。

采用傳統三電極體系，以 5.0 mmol·L－1[Fe（CN）6]4－/3－為氧化還原探針，以修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲為輔助電極，于0.l mol·L－1氯化鉀電解質溶液中，進行電化學阻抗表征。

1.5 氨基甲酸酯類殺蟲劑的檢測

傳感器浸入0.2 mmol·L－1碘化乙酰硫代膽堿的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）中進行差分脈沖伏安掃描，記錄未受氨基甲酸酯類殺蟲劑抑制的傳感器的峰電流I0；然后將該傳感器侵入含不同濃度氨基甲酸酯類殺蟲劑的磷酸鹽緩沖溶液中抑制14 min，洗凈后于0.2 mmol·L－1碘化乙酰硫代膽堿的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）中進行差分脈沖伏安掃描，檢測受氨基甲酸酯類殺蟲劑抑制后的傳感器的峰電流I1，按公式（1）計算氨基甲酸酯類殺蟲劑對該傳感器中酶的抑制率I（%）。

2 結果與討論

2.1 傳感器的交流阻抗表征

利用交流阻抗對傳感器進行表征，結果如圖1所示。由圖1可知：裸電極（a）的界面電子傳遞阻力很大，將羧基化的多壁碳納米管和雙醛纖維素修飾到電極表面（b），阻抗值明顯減少。這是因為功能化的碳納米管極易被溶劑潤濕，能形成較好的電極/溶液界面，加速電子傳遞。而當固定化乙酰膽堿酯酶固定到電極表面（c），阻抗值增加。這是因為乙酰膽堿酯酶的加入，一方面增大了[Fe（CN）6]4－/3－通過膜時的阻力，另一方面使[Fe（CN）6]4－/3－向電極表面擴散的有效截面積也進一步變小，從而導致阻抗值增大，這也說明固定化酶制備成功，且已修飾到電極表面。加Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE 電極（c）與 Chi/DAC-AChE/GCE 電極（d）相比，阻抗值小很多，這是由于羧基化的多壁碳納米管表面帶有大量的羧基，不僅改進了多碳納米管的分散性，而且能加速氧化還原物質與電極間的電子轉移。

圖 1 不同電極在含[Fe（CN）6]4－/3－-氯化鉀溶液中的交流阻抗譜Figure1 Electrochemical impedance spectra of different modified electrodes measured in [Fe（CN）6]4－/3-solution

2.2 Chi/DAC-AChE/GCE的循環伏安特性

圖 2A 為 Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE 電極在 5.0 mmol·L－1鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]-0.1 mol·L－1氯化鉀溶液中不同掃描速率下的循環伏安圖，圖2B為峰電流與掃速平方根的線性關系圖。由圖2可知，在鐵氰化鉀-氯化鉀溶液中隨著掃描速率的增加，電極的還原峰電流和氧化峰電流與掃描速率平方根呈線性關系，線性回歸方程列于表1。圖2結合表1可知：隨著掃速（v）的增加，峰電流（I）亦相應增加，峰電流與掃描速率平方根呈良好的線性關系，說明該電極反應過程受擴散控制。

裸GCE，Chi/DAC/F-CNTs/GCE，Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE和Chi/DAC-AChE/GCE的循環伏安曲線如圖3所示。由圖3可知：在pH 6.6的磷酸鹽緩沖溶液中，Chi/DAC/F-CNTs/GCE修飾電極（a），Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE修飾電極（b）和Chi/DAC-AChE/GCE修飾電極（c）均未觀察到峰出現，說明底物碘化乙酰硫代膽堿不存在時，未見明顯的氧化還原反應。當加入碘化乙酰硫代膽堿后，裸GCE電極（d）和Chi/DAC/F-CNTs/GCE修飾電極（e）上仍沒有峰出現，說明羧基化的多壁碳納米管和雙醛纖維素在該電勢范圍無活性，而Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE修飾電極（f）和Chi/DAC-AChE/GCE修飾電極（g）都出現不可逆氧化峰，此氧化峰是由于乙酰膽堿酯酶催化碘化乙酰硫代膽堿水解生成電活性物質硫代膽堿，硫代膽堿中的巰基被氧化所產生的，且Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE修飾電極（f）的峰電流明顯比Chi/DACAChE/GCE修飾電極（g）的大，說明羧基化的多壁碳納米管有助于氧化還原物質與電極間的電子轉移，電極靈敏度增強。將Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE修飾電極和Chi/DAC-AChE/GCE修飾電極在殺蟲劑1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯中抑制后，再于碘化乙酰硫代膽堿-磷酸鹽緩沖溶液中測試循環伏安曲線（k和h），結果顯示硫代膽堿的氧化電流下降，說明1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯抑制了電極上乙酰膽堿酯酶的活性。利用硫代膽堿氧化產生的電流變化情況可定量分析乙酰膽堿酯酶的活性，表征氨基甲酸酯類殺蟲劑在抑制反應中的作用，通過抑制率可定量檢測氨基甲酸酯類殺蟲劑含量。

圖2 傳感器在不同掃描速率下的循環伏安圖（A）和峰電流與掃速平方根的關系圖（B）Figure2 Cyclic voltammograms of sensor at different scan rates（A） and the dependence of peak currents vs.v1/2（B）

表1 掃速對峰電流影響數據的擬合方程Table1 Equation of the effect of scan rate on the peak current

圖 4（A）為 Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE 傳感器對碘化硫代乙酰膽堿的差分脈沖伏安圖，顯示了傳感器對不同濃度碘化乙酰硫代膽堿檢測的響應性。從圖4（A）可以看出：隨著濃度的增加，電流亦增加，表明乙酰膽堿酯酶已經成功修飾到電極上，且能催化溶液中的碘化乙酰硫代膽堿發生水解。

提取圖4（A）中峰電流，考察峰電流與碘化乙酰硫代膽堿濃度的關系，結果表明：峰電流（I）與碘化乙酰硫代膽堿濃度（c）呈現良好的線性關系，其相關方程為：I=－6.7579c－4.1380（R=0.9958,S=0.0738,N=7,P＜0.01），詳見圖 4（B）。

圖 3 Chi/DAC/F-CNTs/GCE （ a，e），Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE（b，f，k），Chi/DAC-AChE/GCE（c，g，h），裸 GCE（d）在碘化乙酰硫代膽堿-磷酸鹽緩沖液中的循環伏安曲線Figure3 Cyclic voltammograms of the Chi/DAC/F-CNTs/GCE（a,e），Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE（b，f，k），Chi/DACAChE/GCE（c，g，h），bare GCE（d） in ATCh-PBS

2.3 傳感器性能參數的優化

基于農藥對乙酰膽堿酯酶的抑制作用制備傳感器用于農藥的檢測，傳感器的性能主要受電解質溶液pH值和傳感器在農藥中的抑制時間的影響，為此，本研究主要考察了電解質溶液的pH值和傳感器在氨基甲酸類殺蟲劑中的抑制時間對峰電流的影響，結果如圖5所示。對測定數據進行非線性擬合，獲得理論方程如表2所示。

圖4 傳感器對碘化乙酰硫代膽堿的差分脈沖伏安圖（A）和峰電流與碘化乙酰硫代膽堿濃度的關系圖（B）Figure4 Differential pulse voltammetry of ATCh （A） and relationships between peak current and ATCh concentration （B）

從圖5A可知：當磷酸鹽緩沖溶液pH 6.6時，測得的峰電流最大，說明電解質的pH 6.6時更易保持酶的活性，所以本實驗選擇 pH 6.6的磷酸鹽緩沖溶液作為底液。由圖5B可知：在1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯溶液中隨著時間的延長，Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE電極在碘化乙酰硫代膽堿中的峰電流明顯降低，1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯對乙酰膽堿酯酶的抑制作用加強，酶活性在抑制作用的前14 min內迅速減小，當抑制時間超過14 min，乙酰膽堿酯酶的抑制率趨于穩定,表明1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯與乙酰膽堿酯酶中有效基團的結合作用已到達飽和狀態，因此，在1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯的測定過程中，抑制時間選擇為14 min。

圖 5 pH值對Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE的影響（A）和抑制時間與酶抑制率的關系曲線（B）Figure5 Effect of pH on Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE and relationships between inhibiting time and inhibition rate （B）

2.4 傳感器對氨基甲酸酯類殺蟲劑的檢測性能

將Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE傳感器分別浸泡在不同濃度的殺蟲劑1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯標準品中抑制后，測試碘化乙酰硫代膽堿在傳感器上的氧化峰電流，結果如圖6所示。隨著殺蟲劑質量濃度的增大，峰電流逐漸減小，電流的衰減與殺蟲劑的濃度存在一定的關系。以1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯對乙酰膽堿酯酶的抑制率對1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯的質量濃度作圖，如圖6所示，可分為2個線性段：1.5～6.0 μg·L-1和 6.0～16.0 μg·L-1。線性回歸方程列于表 3。按抑制率為 10%時為氨基甲酸酯類殺蟲劑的最低檢出限，得到該傳感器的檢出限為3.5 μg·L-1，傳感器的靈敏度為3.7～5.1 μg·L-1。

2.5 樣品回收率測定

利用1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯標準品，配制10.0 μg·L-1溶液，采用標準加入法測定樣品回收率，結果如表4所示。5次平行測定的回收率為97.89%，說明該生物傳感器用于實際樣品的檢測結果是比較準確的。

表2 pH和抑制時間對傳感器影響數據的擬合方程Table2 Equation of the effect of pH and inhibiting time on the sensor

表3 1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯濃度對酶抑制率影響數據的擬合方程Table3 Equation of the effect of CAB concentration on the inhibition rate

表4 傳感器對1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯的回收率測定Table4 Recoveries of the sensor for CAB

2.6 電極的重復性、穩定性及再生

同一支傳感器在含1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）中抑制14 min后，放入含碘化乙酰硫代膽堿的磷酸鹽緩沖溶液中平行測定10次，峰電流值的相對標準偏差為1.57%，說明該電極的重復性較好。

將傳感器浸泡于磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）中4℃冰箱保存，10 d后，該傳感器的峰電流無明顯降低，1個月后再次測量，響應電流仍能保持初始響應電流的85.0%，說明此法制備的傳感器壽命長且穩定性較好，為酶提供了良好的生物相容性。

圖6 Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE在不同濃度1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯中的微分脈沖伏安圖（A）和酶抑制率與1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯濃度的關系圖（B）Figure6 Differential pulse voltammograms of Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE for different concentration CAB （A）and relationships between inhibition rate and CAB concentration （B）

氨基甲酸酯類殺蟲劑對乙酰膽堿酯酶的強抑制性限制了該類傳感器的重復利用。參照文獻方法[23]將酶電極浸泡在磷酸鹽緩沖溶液中去除部分失活的酶，實現酶片的重復利用。4℃冰箱中，將酶電極在0.1 mol·L－1pH 6.6的磷酸鹽緩沖溶液中浸泡3 d，其峰電流值能夠恢復到原來的 93.5%，與文獻相比[24]，此法簡捷可靠。

2.7 討論

氨基甲酸酯類殺蟲劑抑制乙酰膽堿酯酶活性的機制是：氨基甲酸酯類殺蟲劑進入人體后，抑制乙酰膽堿酯酶活性使酶活性中心絲氨酸的羥基被氨基甲?；蚨ッ笇σ阴Ｄ憠A的水解能力，以致體內乙酰膽堿大量蓄積，使中樞神經系統及膽堿能神經過度興奮，最后轉入抑制和衰竭，引發一系列疾病[25]。有機磷類殺蟲劑進入人體后，其磷?；鶗c乙酰膽堿酯酶的活性部分緊密結合形成磷?；憠A酯酶，同樣可使乙酰膽堿酯酶喪失分解乙酰膽堿的能力，因此，本研究提供的傳感器不但可用于氨基甲酸酯類殺蟲劑的檢測，還可用于有機磷類殺蟲劑的檢測，可以說是有機磷類殺蟲劑檢測的一種新方法。

3 結論

本研究通過化學鍵聯技術將游離酶固定化后修飾到玻碳電極，成功制得了Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE傳感器，利用酶抑制原理建立了檢測氨基甲酸酯類殺蟲劑的方法。該傳感器對典型氨基甲酸酯類殺蟲劑1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯的檢出限可達3.5 μg·L－1。該法與目前直接用游離酶修飾的酶電極方法不同，此法是以固定化酶的形式間接修飾在電極上，制備簡單，方法新穎，不但能較好地保持酶的活性，而且能增強酶在電極表面的穩定性，同時利用羧基化的多壁碳納米管的多孔性，大比表面積，來增強電子傳遞。由于其他氨基甲酸酯類殺蟲劑與1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯對乙酰膽堿酯酶的抑制原理相同，因此，此傳感器同樣適用于其他的氨基甲酸酯類殺蟲劑，在檢測氨基甲酸酯類殺蟲劑殘留的應用中具有廣闊的前景。

[1]HAYAMA T,YOSHIDA H,TODOROKI K,et al.Determination of polar organophosphorus pesticides in water samples by hydrophilic interaction liquid chromatography with tandem mass spectrometry [J].Rapid Commun Mass Spectrom,2008,22（14）∶2203 － 2210.

[2]趙穎，蔣施，金雁，等.食用菌中多種氨基甲酸酯類農藥殘留的超高效液相色譜-串聯質譜法測定研究[J].化學通報，2012，75（2）：150 － 154.ZHAO Ying,JIANG Shi,JIN Yan,et al.Study on UPLC-MS/MS method for determination of carbamate pesticide residue in mushrooms [J].Chemistry,2012,75（2）∶150 － 154.

[3]金立弟，趙明會，韓宇.GC-MS法測定銀杏葉中3種氨基甲酸酯類農藥的殘留量[J].藥物分析，2011，31（7）：1379－1380.JIN Lidi,ZHAO Minghui,HAN Yu.GC-MS determination 3 kinds of carbamate pesticides in Ginkgo biloba [J].Chin J Pharmacl Anal,2011,31（7）∶1379 － 1380.

[4]XU Zhixiang,FANG Guozhen,WANG Shou.Molecularly imprinted solid phase extraction coupled to highperformance liquid chromatography for determination of trace dichlorvos residues in vegetables [J].Food Chem,2010,119（2）∶845－850.

[5]林詩云，吳曉波，陳海云，等.固相萃取-高效液相色譜法測定水中6種氨基甲酸酯類農藥殘留量[J].農藥，2010，49（12）：909 － 911.LIN Shiyun,WU Xiaobo,CHEN Haiyun,et al.Determination of six carbamates pesticide residues in water by SPEHPLC [J].Chin J Pest,2010,49（12）∶909 － 911.

[6]杜曉婷，周敏，張劍，等.蔬菜中甲胺磷等5種有機磷農藥殘留量的分散液-液微萃?。瘹赓|聯用技術檢測[J].分析測試學報，2010，29（7）：751 － 754.DU Xiaoting,ZHOU Min,ZHANG Jian,et al.Determination of five organophosphorus pesticide residues in vegetables based on dispersive liquid-liquid microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry [J].J Instrum Anal,2010,29（7）∶751 － 754.

[7]閔紅，曲云鶴，李曉華，等.Au摻雜Fe3O4納米粒子酶傳感器的制備及其應用于有機磷農藥檢測的研究[J].化學學報，2007，65（20）：2303－ 2308.MIN Hong,QU Yunhe,LI Xiaohua,et al.Au-doped Fe3O4nanoparticle immobilized acetylcholinesterase sensor for thedetection of organophosphorus pesticide [J].Acta Chem Sin,2007,65（20）∶2303 － 2308.

[8]孫春燕，李宏坤，平紅，等.AuNPs/Sol-gel復合膜法固定乙酰膽堿酯酶生物傳感器檢測有機磷農藥[J].高等學?；瘜W學報，2011，32（11）：2533－2538.SUN Chunyan,LI Hongkun,PING Hong,et al.Determination of organophosphorus pesticides using a biosensor based on acetylcholinesterase immobilized by AuNPs/Sol-gel composite membrane [J].Chem J Chin Univ,2011,32（11）∶2533－2538.

[9]干寧，王峰，楊欣，等.采用納米修飾雙酶電極生物傳感器檢測有機膦與氨基甲酸酯類農藥[J].農藥學學報，2008，10（3）：329 － 334.GAN Ning,WANG Feng,YANG Xin,et al.A nano particles modified bienzyme electrode biosensor for the detection of carbamate and organophosphorus pesticides [J].Chin J Pest Sci,2008,10（3）∶329 － 334.

[10]張君，王月伶，袁倬斌.可檢測有機磷農藥殘留的絲網印刷酶電極[J].化學學報，2006，64（5）：428－434.ZHANG Jun,WANG Yuelian,YUAN Zhoubin.Screen-printed enzyme electrodes for detection of organophosphate pesticide residue [J].Acta Chem Sin,2006,64（5）∶428 － 434.

[11]CHEN Haode,ZUO Xiaolei,SU Shao,et al.An electrochemical sensor for pesticide assays based on carbon nanotube-enhanced acetychoinesterase activity [J].Analyst,2008,133（9）∶1182 － 1186.

[12]DU Dan,CHEN Shizhen,CAI Jie,et al.Electrochemical pesticide sensitivity test using acetylcholines-terase biosensor based on colloidal gold nanoparticle modified sol-gel interface [J].Talanta,2008,74（4）∶766 － 772.

[13]DU Dan,CAI Jie,SONG Dandan,et al.Rapid determination of triazophos using acetylcholinesterase biosensor based on sol-gel interface assembling multiwall carbon nanotubes [J].J Appl Electrochem,2007,37（8）∶893 － 898.

[14]SUN Xia,WANG Xiangyou,ZHAO Wenping.Multiwall carbon nanotube-based acetylcholinesterase biosensor [J].Sensor Lett,2010,8（2）∶247 － 252.

[15]DU Dan,WANG Minghui,CAI Jie,et al.Sensitive acetylcholinesterase biosensor based on assembly of β-cyclodextrins onto multiwall carbon nanotubes for detection of organophosphates pesticide [J].Sens Actu B Chem,2010,146（1）∶337 － 341.

[16]WUHaichen，CHANG Xueling,LIU Lei,et al.Chemistry of carbon nanotubes in biomedical applications[J].JMater Chem,2010,20（6）∶1036 － 1052.

[17]孫霞，趙文蘋，劉中合，等.基于功能化多壁碳納米管的乙酰膽堿酯酶生物傳感器制備[J].食品科學，2012，33（4）：282 － 286.SUN Xia,ZHAO Wenping,LIU Zhonghe,et al.Preparation of acetylcholinesterase biosensor based on functionalized multi-walled carbon nanotubes for pesticides detection [J].Food Sci,2012,33（4）∶282 － 286.

[18]高慧麗，康天放，王小慶，等.溶膠-凝膠法固定乙酰膽堿酯酶生物傳感器測定有機磷農藥[J].環境化學，2005，24（6）：707 － 710.GAO Huili,KANG Tianfang,WANG Xiaoqing,et al.Determ ination of organophosphorus pesticides using a biosensor of acetylcholinesterase mmobilized by sol-gel method [J].Environ Chem,2005,24（6）∶707 － 710.

[19]SHULGA O,KIRCHHOFF J R.An acetylcholinesterase enzyme electrode stabilized by an electrodepo-sited gold nanoparticle layer[J].Electrochem Commun,2007,9（5）∶935 － 940.

[20]高鹽生，王媛，狄俊偉.硅溶膠-凝膠包埋納米金和酶的葡萄糖生物傳感器[J].應用化學，2011，27（3）：363－366.GAO Yansheng,WANG Yuan,DI Junwei.Glucose biosensor based on gold nanoparticles and enzyme embedded in silica sol-gel network [J].Chin J Appl Chem,2011,27（3）∶363 － 366.

[21]MA Houyi,CHEN Shenhao,NIU Lin,et al.Studies on electrochemical behavior of copper in aerated NaBr solutions with Schiff bases [J].Electrochem Soc,2001,148（5）∶208 － 216.

[22]GROSS A R,KALRA B.Biodegradable polymers for the environment[J].Science,2002,297∶803 － 807.

[23]SUN Xia,WANG Xiangyou,LIU Zhen.Study on immobilization methods of acetylcholinesterase [J].Int J Food Eng,2008,4（8）∶1 － 11.

[24]ANITHA K,MOHAN S V,REDDY S J.Development of acetylcholinesterase silica sol-gel immobilized biosensoran application towards oxydemeton methyl detection [J].Bios Bioelectr,2004,20（4）∶848 － 856.

[25]GARBIN J R,MILORI D M B P,SIMOES M L,et al.Influence of humic substances on the photolysis of aqueous pesticide residues [J].Chemosphere,2007,66（9）∶1692 － 1698.