外源菌群煤生物氣化初步研究:菌群結構、煤種及煤孔(裂)隙

王保玉,陳林勇,邰 超,3,韓作穎,關嘉棟,趙 晗

(1.中國礦業大學(北京)地球科學與測繪工程學院,北京 100083;2.國家能源煤與煤層氣共采技術重點實驗室,山西 晉城 048204;3.河南理工大學資源環境學院,河南焦作 454000)

外源菌群煤生物氣化初步研究:菌群結構、煤種及煤孔(裂)隙

王保玉1,2,陳林勇2,邰 超2,3,韓作穎2,關嘉棟2,趙 晗2

(1.中國礦業大學(北京)地球科學與測繪工程學院,北京 100083;2.國家能源煤與煤層氣共采技術重點實驗室,山西 晉城 048204;3.河南理工大學資源環境學院,河南焦作 454000)

以河南義馬煤礦、山西山陰煤礦和雙柳煤礦不同煤階煤為研究對象,利用沼液經逐步馴化得到的外源產甲烷菌群為菌源,在千克級的水平上進行了煤生物氣化模擬實驗。采用16S rDNA測序對馴化得到的菌源進行初步確定,并研究了馴化菌源對不同煤種的氣化效果,采用掃描電鏡初步研究了馴化微生物形態與煤孔(裂)隙的可能作用。結果表明,不同煤樣外源菌群煤生物氣化均存在產氣周期,可分為快速、緩慢和抑制3個階段,而不同煤種氣化階段存在明顯差異。16S rDNA測序結果顯示,甲烷絲狀菌屬(Methanothrix)占0.02%,而典型的和煤的骨架芳香結構降解相關的微生物類群占約8%,表明降解步驟是煤生物氣化的速控步驟。掃描電鏡觀察發現,馴化后的菌群以球狀和桿狀為主,部分微生物進入煤的孔裂隙。當以塊狀煤為底物長期馴化菌源時,菌群的產氣效率明顯降低。

煤;微生物成氣;菌群結構;煤種;煤孔隙;菌群活性

利用生物作用把煤轉變成氣體燃料(例如甲烷)的技術,被稱為“煤生物氣化”,是煤炭綜合加工利用的一種新的嘗試和努力,盡管距離其最終目標實現煤的地下生物氣化尚有一定的距離,但與傳統的煤氣化技術相比,該技術低能耗、綠色、環保,具有探索的價值。Scott等的研究表明,次生生物氣是煤層氣的一個重要來源[1],說明煤具有生物氣化的潛力。近年來,生物成因煤層氣越來越受到國際煤層氣領域的關注[2],針對煤生物氣化的研究,從菌源來看可以分為外源產甲烷菌群和煤層天然本源微生物,兩種來源的微生物均可實現煤的氣化[3-7]。

筆者以河南義馬煤礦、山西山陰煤礦和雙柳煤礦不同煤階煤為研究對象,利用自制沼液經逐步馴化得到的外源產甲烷菌群為菌源,在千克級的水平上進行了煤生物成氣模擬實驗。采用16S rDNA測序對馴化得到的菌源進行初步確定,并研究了馴化菌源對不同煤種的氣化效果,采用掃描電鏡初步研究了馴化微生物形態,探討了煤孔(裂)隙的可能作用。

1 實驗方案

1.1 煤樣與菌群

實驗用煤樣采自河南義馬煤礦、山西大同山陰煤礦、呂梁雙柳煤礦,塊狀煤直徑5～15 cm,堆放半年以上,煤工業分析結果見表1?？梢钥闯?從揮發分產率(Vdaf)看,義馬和大同的煤樣煤階要低于呂梁煤樣。

表1 煤樣的工業分析結果Table 1 The proximate analysis of coal sample %

秸稈采自山西晉城市田間,將義馬煤樣進行粉碎,對其中85～100目的煤粉進行氣化實驗,大于100目的煤粉用于菌群的馴化實驗。厭氧菌群采用實驗室自制的小型沼氣池的沼液進行馴化。

1.2 營養液

1 L純水中加入抗壞血酸0.5 g,EDTA 0.5 g,酵母粉2 g,K2HPO42.9 g,KH2PO41.5 g,NH4Cl 1.8 g, MgCl20.4 g,微量元素液100 μL,維生素液50 μL。

微量元素:FeSO4·7H2O 21 g;ZnCl20.7 g; MnSO4·H2O 1 g;CoCl2·6H2O 1.9 g;CuSO4·5H2O 0.03 g;NiCl2·2H2O 0.24 g;Na2MO4·2H2O 0.36 g; KAl(SO4)20.1 g;H3BO30.06 g;純水100 mL。

維生素:硫辛酸0.05 g,維生素B12 0.001 g,鹽酸吡多辛0.1 g,生物素0.02 g,煙酸0.05 g,葉酸0.02 g,D-泛酸鈣0.05 g,對氨基苯甲酸0.05 g,純水100 mL。

1.3 實驗方法

1.3.1 厭氧菌群馴化

將500 g采集的秸稈切碎,長度約為5 cm,用清水沖洗掉其上的泥土等殘渣后裝入18 L密閉容器,加入10 L培養基,500 g新鮮豬糞,曝氮氣30 min,密封,8 d后,以大于100目的褐煤煤粉為底物進行逐步馴化[8-9],得到實驗用厭氧菌源。

1.3.2 微生物基因組提取及16S rDNA擴增測序

DNA的提取采用試劑盒(EZNA water DNA kit), 16S rDNA V6高變區片段擴增引物為V6-F(5’-CAACGCGARGAACCTTACC-3’),V6-R(5’-CGACAGCCATGCANCACCT-3’)。PCR擴增反應體系為:TaKaRaEx Taq Buffer(含鎂、含dNTPs)25 μL,引物(10 μmol/L)各1.5 μL,模板2 μL,加無菌水至50 μL。PCR反應條件為:94℃預變性3 min,98℃變性10 s,57℃退火30 s,72℃延伸30 s,共31個循環,最后在72℃延伸2 min。PCR反應產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,測序由深圳華大基因科技服務有限公司完成。

1.3.3 生物成氣模擬實驗

在140 L自制發酵罐中,進行生物成氣模擬實驗。其中,煤樣30 kg,加入60 L營養液,曝氮氣30 min,用蠕動泵泵入10 L馴化液,再曝氣10 min。發酵罐溫度35℃,用5 L氣袋收集產生的氣體,用氣相色譜進行氣體成分分析。

1.3.4 生物作用后煤樣的掃描電鏡觀察

取微生物作用后的大小合適的煤塊,利用25%, 50%,75%,95%的乙醇對其上的微生物進行梯度脫水后[10]利用掃描電鏡觀察。

1.3.5 不同時間馴化液活性實驗

發酵罐模擬產氣約28 d為一個周期,30 kg義馬煤塊每完成一個產氣周期,將30 L馴化液排出,重新補加等量的營養液,作為菌源隨時取用。在100 mL厭氧瓶中,加入1.5 g的85～100目義馬煤粉,57 mL營養液,曝氣1 min后放入DWS厭氧工作站,接種1個月的馴化液5 mL,35℃恒溫培養,每隔4～5 d取氣體樣品測量甲烷含量,實驗結束后將厭氧瓶中的氣體導出。以第12個月的馴化液為菌源重復實驗。

1.3.6 氣體成分測定

儀器選用美國Angilent 7890氣相色譜儀,配Carbonplot色譜柱(60 m×320 μm×1.5 μm)和TCD檢測器,氣密針進樣,進樣量0.5 mL。色譜進樣口溫度150℃,柱溫箱溫度25℃,檢測器溫度200℃。

2 實驗結果分析

2.1 微生物16S rDNA測序結果分析

馴化液的測序結果顯示微生物主要分布在細菌域(82.44%),少數分布在古菌域(0.02%),還有部分不確定(17%)。古菌域的0.02%全部是甲烷絲狀菌(Methanothrix)。在檢測到的細菌域20個門(Phylum)中,變形菌門(Proteobacteria)占22.93%,厚壁菌門(Firmicutes)占18.11%,螺旋體門(Spirochaetes)占10.98%,擬桿菌門(Bacteroidetes)占10.42%,放線菌門(Actinobacteria)占2.17%,硝化螺菌門(Nitrospira)占1.23%,其他菌門占比均小于1%(圖1)。變形菌門的鞘氨醇菌屬(Sphingomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(2.08%)、互營桿菌屬(Syntrophobacter)(0.25%)、不動桿菌屬(Acinetobacter)(0.76%)等,放線菌門的分枝桿菌屬(Mycobacterium),諾卡氏菌(Nocardia)(0.08%)等,擬桿菌門的黃桿菌屬(Flavobacterium)(0.12%)等,厚壁菌門的芽孢桿菌屬 (Bacillus)(0.12%)、梭 菌 屬 (Clostridium) (3.15%)等,在多環芳烴等難降解有機物的生物降解中起重要用[11-15],硝化細菌可促進水中溶解性含氮物質的轉化[16-17],螺旋體門的螺旋體屬可降解碳水化合物產生乙醇、乙酸、乳酸、氫氣和二氧化碳[18-20]。

圖1 馴化液菌群結構Fig.1 Bacteria communities of the domesticated microbes

煤的生物降解多基于煤的基本結構單元含類木質素、芳環和一些官能團[20-23],煤的降解結果也顯示其芳環縮合度降低,脂肪鏈斷裂,含氧官能團減少[24]。馴化液中含有產甲烷必要的菌群,典型的產甲烷菌群占整個菌群比約8%。甲烷絲菌屬僅占0.02%可能有兩方面原因:①產甲烷菌是產甲烷生物鏈上的最后一個環節,不是速控步驟;②PCR擴增的引物是細菌的通用引物,對古菌的擴增效果不理想。

2.2 生物氣化模擬實驗結果

研究表明,無煙煤中的天然產甲烷菌群產氣可達到85 d[5]。褐煤中的天然產甲烷菌群的一個產氣周期為55 d左右,一個產氣周期又可以分為生氣量緩慢增長、顯著增高、趨于減緩3個階段[4],這與本研究中實驗室模擬的外源產甲烷菌群產氣規律不同,外源產甲烷菌群的產氣周期較短,一般在28 d左右(圖2,圖中百分數代表甲烷含量)。原因可能有兩方面:①上述文獻中的煤為粉末狀,比表面積大,有利于微生物的作用;②經過馴化的外源產甲烷菌群對煤的降解效果比天然產甲烷菌群強,降解速度較快。

圖2 不同煤樣成氣效果Fig.2 The gas production of different coal samples

從圖2可以發現,3種煤樣的產氣均可以分為3個階段:產氣速率快速增高、緩慢升高、趨于停止。義馬煤樣第1階段為0～7 d,第2階段為8～21 d,第3階段為22～28 d。大同和呂梁煤樣第1階段為培養開始至6～10 d,第2階段為11～21 d,第3階段為22～28 d。

快速成氣階段的出現可能與微生物培養基中的有機質有關,培養基中的相對于煤來說分子結構簡單,易于被微生物利用,實現了第1階段的的快速產氣。而在第2個階段中,微生物開始利用煤中可降解的部分產氣,直到第22天產氣基本停止,其原因可能是因為微生物的代謝產物積累,產生了反饋抑制。

值得注意的是,煤階較高的呂梁和大同煤樣氣化的第1階段末期即6～10 d出現了相對平穩的階段,這可能是由于相對于低階煤,較高階煤降解需要較長的時間。有關煤生物成氣特征與煤炭基質及微生物來源方面的關系尚需進一步研究。

2.3 微生物作用后煤樣的掃描電鏡觀察

生物氣化是一個由多種微生物構成的菌群共同完成的過程。如圖3所示,菌群以球狀和桿狀微生物為主。圖3(a)中的桿菌長為 1.899 μm,直徑為736.9 nm;圖3(b)中的兩個球菌直徑分別為742.3和737.2 nm;圖3(c)中的裂隙寬度為2.072 μm,孔隙直徑為 744.8 nm;圖 3(d)中的球菌直徑為915.5 nm,裂隙寬度為2.539 μm。

圖3 微生物處理后煤表面微生物Fig.3 Representative SEM micrographs of coal and microbes on the coal surface

可以發現:①部分微生物可進入煤中的一些孔隙;②孔隙占煤體積的比例小?，F有的理論認為,難降解的高分子物質能被微生物降解的前提是能與微生物或其胞外酶接觸。因此,與相同質量的煤粉相比,以塊狀煤為底物時比表面積小,對于微生物來說有效基質量就少。當能與微生物接觸部分的營養物質被利用完,而煤塊內部的營養物質不能被利用時,產氣周期就有可能結束,以此時的塊煤作為底物馴化外源產甲烷菌群時,菌源的活性可能降低。

2.4 不同時間馴化液活性實驗結果

以義馬煤為研究對象,對馴化時間對馴化液產甲烷活性的影響進行了初步研究,結果如圖4所示。從圖4(a)可以看出,在初始馴化階段實驗組甲烷含量的上升明顯高于對照組,且實驗組的甲烷終含量為25.5%,也高于對照組16.6%。實驗結束后將厭氧瓶中的氣體導出,實驗組導出氣體61 mL,對照組導出37 mL。說明外源產甲烷菌群可以利用褐煤煤粉產氣。

如圖4(b)所示,以12個月的馴化液為菌源時,實驗組與對照組的產氣速率差別不大,甲烷終含量實驗組為29.4%,對照組為30.5%,對照組略高于實驗組,且兩組均未能從厭氧瓶中導出氣體。

圖4 馴化初、末期馴化液成氣效果Fig.4 The gas production by the tail domestication microbes

兩組實驗所用的底物及營養液相同,菌源不同。出現不同結果的原因可能是:隨著發酵時間的延長,可提供營養物質的煤的有效基質基本被完全消耗,馴化得到的可以降解煤的部分微生物逐漸失去了優勢,第12個月馴化液中的菌群只能利用營養液,煤粉的存在甚至部分抑制了微生物對營養液的利用。

3 結 論

(1)外源產甲烷菌群進行塊煤的生物氣產出模擬時,產氣周期為28 d左右;培養開始至7～10 d為產氣周期的第1個階段,微生物利用營養液產氣。第1階段末期至產氣的21 d為第2階段,微生物利用煤產氣,22～28 d,產氣趨于停止。

(2)利用馴化的菌源降解煤產氣,其馴化液中含有典型的產甲烷菌群;部分微生物可以進入煤的一些孔隙結構,因此煤的孔隙結構決定了煤有效基質的量,對產氣速率和產氣量有重要影響。

(3)塊狀煤馴化的菌液到第12個月菌源活性降低。原因在于煤塊的有效部分是其外表面及孔隙部分,有效基質被利用完后,不經過處理的塊煤不能再用于產氣或微生物馴化。

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A preliminary study of biological coal gasification by exogenous bacteria: Microbiome composition,coal type,pore and seam fracture

WANG Bao-yu1,2,CHEN Lin-yong2,TAI Chao2,3,HAN Zuo-ying2,GUAN Jia-dong2,ZHAO Han2

(1.College of Geosciences and Surveying Engineering,China University of Mining and Technology(Beijing),Beijing 100083,China;2.State Energy Key Laboratory of Joint Exploitation of Coal and Coal-bed Methane,Jincheng 048204,China;3.Institute of Resources and Environment,Henan Polytechnic University,Jiaozuo 454000,China)

With the coal samples from Yima in Henan Province,Shanyin in Shanxi Province and Shuangliu in Shanxi Province,the biological coal gasification by exogenous bacteria were studied at the kilogram levels.The microbiome composition was identified by 16S rDNA method.Morphology of microorganisms and the interaction of microorganisms and coal were investigated by scanning electron microscope.The results show that the biological coal gasification by exogenous bacteria can be divided into three stages:a rapid growth stage,a stable stage,and an inhibition stage.There are apparent differences at the three stages between the different coal samples.16S rDNA sequence analysis show that Methanothrix accounts for only 0.02%,while other typical microorganisms related to degradation of coal account for 8%.Scanning electron microscope observation show that the microorganisms are mainly spherical and rod-shaped.Some of the microorganisms can enter the coal fissure/pore,which account for a small proportion of coal.With the lump coal for thesubstrate long-term domestication bacterium source,the gas efficiency of bacteria obviously decreases.

coal;biogenic gas;microbiome composition;coal type;fissure;microbial activity

TQ53;P618.11

A

0253-9993(2014)09-1797-05

2014-05-02 責任編輯:畢永華

山西省煤層氣聯合基金資助項目(2013012016,2012012013);河南省基礎與前沿技術研究計劃資助項目(122300410241)

王保玉(1960—),男,河南周口人,高級工程師。Tel:0356-2689298,E-mail:wbyjmjt@163.com。通訊作者:邰 超(1978—),男,河南南陽人,副教授。Tel:0356-2689298,E-mail:taichao@126.com

王保玉,陳林勇,邰 超,等.外源菌群煤生物氣化初步研究:菌群結構、煤種及煤孔(裂)隙[J].煤炭學報,2014,39(9):1797-1801.

10.13225/j.cnki.jccs.2014.8009

Wang Baoyu,Chen Linyong,Tai Chao,et al.A preliminary study of biological coal gasification by exogenous bacteria:Microbiome composition,coal type,pore and seam fracture[J].Journal of China Coal Society,2014,39(9):1797-1801.doi:10.13225/j.cnki.jccs.2014.8009