p40、TTF-I、p63、CK5/6在肺腺癌和肺鱗癌中的表達及其意義

焦立卓，陳涵斌，趙靈靈，王玲，林中民，陳霖，陳國榮，蔡國平

（溫州醫科大學附屬第一醫院 病理科，浙江 溫州 325015）

目前肺癌的發病率仍居高不下，嚴重威脅著人們的健康。肺腺癌有靶向治療，但如果肺鱗癌患者采用了肺腺癌靶向治療的藥物會導致嚴重出血。 新治療方法的療效取決于腫瘤的組織學特征，所以肺腺癌和肺鱗癌的鑒別，尤其是中-低分化肺腺癌與中-低分化肺鱗癌的鑒別具有很重要的臨床意義。目前應用TTF-1、p63、CK5/6等免疫組織化學指標來鑒別肺腺癌和肺鱗癌的技術已經比較成熟，但其特異度和敏感度均不是很高。近來，國外研究顯示，ΔNp63（p40）似乎是一個更可靠的肺鱗癌的標記物[1]。本實驗通過免疫組織化學法，檢測p40、TTF-1、p63、CK5/6在肺腺癌和肺鱗癌中表達的差異性，并分析4種蛋白表達與肺癌患者臨床病理指標之間的關系。

1 材料和方法

1.1 一般資料 收集2011年1月-2012年12月溫州醫科大學附屬第一醫院手術切除的肺腺癌標本108例、肺鱗癌病理標本66例。統計前經本院2位病理科醫生重新讀片，核實診斷。肺癌病理標本中男121例，女53例，年齡≥60歲的110例，＜60歲的64例。肺癌中高分化組18例，中分化組92例，低分化組64例。TNM分期[2]：I期與II期139例，III期35例。腫塊直徑≥3 cm的103例，＜3 cm的71例。無吸煙病史的83例，有吸煙史且＜30年的20例，≥30年的71例。淋巴結轉移62例，未轉移112例。

1.2 試劑和儀器 所用一抗包括兔抗人單克隆抗體p40，鼠抗人單克隆抗體p63，鼠抗人單克隆抗體CK5/6及鼠抗人單克隆抗體TTF-1；二抗PV-9000試劑盒，顯色DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物有限公司；p40購自Abcam（香港）有限公司，組織芯片制備儀TM-1購自北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 組織芯片制作：復習所有患者的常規HE切片，顯微鏡下觀察，每例選取3個（2處癌，1處癌旁）最具代表性病變的位置做定位標記，在其對應蠟塊上找出所標記部位，采用組織芯片制備儀在預先制備好的空白受體蠟塊上打孔，在做好標記的蠟塊上鉆取定位部位的組織柱，按設計方案植入受體蠟塊，形成一個微陣列。制作9×9組織芯片2個，9×8組織芯片5個，9×7組織芯片1個。同時收集乳腺癌、正常前列腺、皮膚、甲狀腺組織各一塊，脫水包埋，制作蠟塊，取組織柱放在微陣列旁作對照。

1.3.2 免疫組織化學染色：常規4μm組織芯片切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，10%過氧化氫阻斷液阻斷內源性過氧化物酶10 min，高壓熱修復，修復液均為pH 8.0的EDTA液，自然冷卻，加一抗，4 ℃過夜，加二抗后37 ℃孵育30 min，DAB顯色。p40、p63、CK5/6、TTF-1分別用乳腺癌組織、前列腺組織、皮膚、甲狀腺組織做陽性對照，陰性對照均以PBS液代替一抗。

1.3.3 結果判定：p40、p63及TTF-1陽性細胞染色均位于細胞核，CK5/6陽性細胞染色位于細胞質。由2位病理醫師對免疫組織化學檢測結果進行評估。染色強度評分標準：依據切片中4個40倍物鏡視野中陽性細胞所占觀察同類細胞數的百分比判斷結果：陽性細胞0%～10%為“-”，11%～50%為“+”，51%～75%為“++”，75%～100%為“+++”。

1.4 統計學處理方法 應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。組間差異性比較、蛋白表達與臨床病理指標比較采用x2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p40、p63、CK5/6、TTF-1蛋白在肺鱗癌中的表達 p40在66例肺鱗癌中的陽性表達率為93.9%（62/66），其中“+”12例、“++”27例、“+++”23例，見圖1。p63在肺鱗癌中的陽性表達率為86.4%（57/66），其中“+”14例、“++”25例、“+++”18例，見圖2。CK5/6在肺鱗癌中的陽性表達率為89.4%（59/66），其中“+”17例、“++”21例、“+++”21例，見圖3。TTF-1的陽性表達率為6.1%（4/62），其中“+”2例、“++”1例、“+++”1例，見圖4。

2.2 TTF-1、p40、p63、CK5/6蛋白在肺腺癌中的表達 TTF-1在108例肺腺癌中的陽性表達率為95.4%（103/108），其中“+”22例、“++”40例、“+++”41例（見圖5）。p40的陽性表達率為3.7%（4/108），“+”4例，見圖6。p63陽性表達率為22.2%（24/108），其中“+”20例、“++”4例。CK5/6的陽性表達率為24.1%（26/108），其中“+”18例、“++”8例。

2.3 p40在肺鱗癌診斷中的優勢 p40、p63、CK5/6在肺鱗癌中的特異度分別是96.3%、77.8%、75.9%，三者的特異度經統計學分析差異有統計學意義（P＜0.05），p40對肺鱗癌的特異度高于p63、CK5/6（P＜0.05），p63與CK5/6對肺鱗癌的特異度差異無統計學意義（P＞0.05）；三者對肺鱗癌的靈敏度分別是93.9%、86.4%、89.4%，差異無統計學意義（x2=3.526，P=0.172），見表1。

圖1 p40在肺鱗癌中呈強陽性表達（×400）

圖4 TTF-1在肺鱗癌中的強陽性表達（×400）

圖2 p63在肺鱗癌中呈強陽性表達（×400）

圖5 TTF-1在肺腺癌中呈強陽性表達（×400）

圖3 CK5/6在肺鱗癌中呈強陽性表達（×400）

圖6 p40在肺腺癌中的弱陽性表達（×400）

表1 p40、p63、CK5/6、TTF-1蛋白在肺癌中的表達

2.4 p40、p63、CK5/6、TTF-1與臨床病理指標之間的相關性 p40、p63、TTF-1與性別、病理類型、腫塊大小、吸煙史有關（均P＜0.05），與年齡、分化程度、淋巴結轉移及TNM分期無關（均P＞0.05）；CK5/6與性別、病理類型、腫塊大小、吸煙史及分化程度有關（均P＜0.05），與年齡、淋巴結轉移及TNM分期無關（均P＞0.05）。具體見表2。

2.5 p40、p63、CK5/6在不同分化程度肺鱗癌中的表達 在低分化肺鱗癌中p40的陽性表達率（為89.3%）高于p63（為78.6%）和CK5/6（為75.0%），在高、中分化肺鱗癌中三者的陽性表達率差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

3 討論

目前對于分化程度較好的肺腺癌和肺鱗癌，兩者鑒別一般不存在困難，但是對于低分化肺腺癌和肺鱗癌的鑒別仍具有挑戰性，需要進行免疫組織化學染色標記區分。組織芯片技術適于研究腫瘤群體，能夠很好地反映免疫組織化學指標與腫瘤臨床病理參數之間的關系。

3.1 p40、p63、CK5/6、TTF-1在肺腺癌和肺鱗癌中的表達情況 文獻報道TTF-1在肺腺癌的陽性表達率為27%～100%[3-4]。國內王紅梅等[5]研究發現TTF-1在肺腺癌中的陽性表達率為84.6%，在肺鱗癌中的陽性表達率為5%。TTF-1還可以在肺小細胞癌及腦組織中表達[6]，陽性表達率各研究報道不一。本研究中TTF-1在108例肺腺癌中的陽性表達率為95.4%（103/108），在肺鱗癌中的陽性表達率為6.1%（4/62），肺腺癌中TTF-1的陽性表達率高于文獻報道，可能與本研究采用的陽性判斷標準及標本均為手術切除標本有關。肺鱗癌中TTF-1的陽性表達率與文獻報道較一致。

p63基因編碼兩類轉錄產物：一類是與p53相似的酸性N端反式激活區的全長p63（TAp63），其功能與p53類似，能反式激活p53靶基因的轉錄并且可以誘導細胞凋亡；另一類為缺乏酸性N端反式激活區的截短p63（△Np63），其喪失了反式激活p53靶基因及誘導細胞周期停滯、細胞凋亡的功能[7]。Nonaka等[8]的研究中檢測了p63、p40及TTF-1在150例肺腺癌和50例肺鱗癌中的表達，結果顯示，p40選擇性地表達在鱗癌，p63不僅限于鱗癌，在腺癌中的陽性表達率約15%，其表達可以是彌漫的，p63在除外黏液型腺癌的所有亞型腺癌中均表達。p40在所有肺腺癌呈陰性。p63陽性的低分化肺腺癌可能被錯誤地診斷為肺鱗癌。力超等[9]檢測了p40、p63、TTF-1在107例肺鱗癌和119例肺腺癌中的表達，結果顯示p40、p63的靈敏度、特異度分別為93.5%、97.5%和94.4%、74%。Bishop等[1]檢測了p40、p63在81例肺鱗癌、237例肺腺癌和152例大細胞淋巴瘤中的表達，p40的靈敏度為100%，特異性為98%；p63的靈敏度為100%，特異性為60%。本實驗結果顯示p40、p63、CK5/6在肺鱗癌中的靈敏度分別是93.9%、86.4%、89.4%，差異無統計學意義（P＞0.05）；特異度分別是96.3%、77.8%、75.9%，經統計學分析差異有統計學意義（P＜0.05）。p40在肺鱗癌中有50例呈“++、+++”（陽性細胞比例為51%～100%），12例呈“+”（陽性細胞比例為11%～50%），強陽性表達率為80.6%；p63強陽性表達率為75.4%（43/57）；CK5/6強陽性表達率71.2%（42/59）。在肺腺癌中p40陽性表達率為3.7（4/108），4例均呈“+”（陽性細胞比例為11%～50%）；p63陽性表達率為22.2%（24/108）；CK5/6陽性表達率為24.1%。上述實驗結果與文獻報道的基本一致。證實p40與p63、CK5/6相比，是一個更可靠的肺鱗癌標記。

表2 p40、p63、CK5/6、TTF-1的表達與肺癌臨床病理指標的相關性

表3 p40、p63、CK5/6的表達與鱗癌分化程度的關系 n（%）

3.2 p40、p63、CK5/6、TTF-1與臨床病理指標之間的相關性 有文獻報道TTF-1蛋白在女性、不吸煙、高分化及無癥狀者中升高明顯，主要表達于肺腺癌。p63蛋白陽性多見于男性、有吸煙史者，其表達隨著肺鱗癌的分化程度增加而增加，與臨床分期呈負相關。logistic多因素分析顯示，患者有無吸煙史及病理類型為影響TTF-1、p63表達的因素[10]。張瑞萍等[11]指出TTF-1的陽性表達率與肺癌組織類型密切相關，分化程度、淋巴結轉移及臨床分期無關。本研究中p40、p63、TTF-1的表達與性別、病理類型、腫塊大小、吸煙史有關，與年齡、分化程度、淋巴結轉移及TNM分期無關；CK5/6除了與性別、病理類型、腫塊大小、吸煙史有關外，還與分化程度有相關性，與年齡、淋巴結轉移及TNM分期無關。結果顯示肺癌患者的一些臨床病理指標與免疫組織化學指標表達的陽性率之間存在相關性。

3.3 p40、p63、CK5/6在不同分化程度肺鱗癌中的表達 在低分化肺鱗癌中p40的陽性表達率（為89.3%）高于p63（為78.6%）和CK5/6（為82.1%），本實驗中由于收集的高分化鱗癌例數過少，尚不能說明各指標在高分化鱗癌中的陽性表達率是否存在差異，但在實際工作中，高分化肺鱗癌較易通過常規病理形態學得以確診，而p40對低分化肺鱗癌的鑒別是優于p63、CK5/6的。

綜上所述，p40在肺鱗癌的鑒別中有較高的特異度，其對低分化肺鱗癌的鑒別也存在優勢，對臨床工作中難以鑒別的肺鱗癌和肺腺癌具有較高的實用價值。但本實驗只是初步探討了p40、p63、CK5/6、TTF-1對肺鱗癌和肺腺癌的鑒別等應用價值及其表達與患者臨床病理指標之間的關系，由于肺腺癌和肺鱗癌的明確鑒別具有重要的臨床意義，所以我們需要進一步探索和尋找更好的免疫組織化學指標，并明確各免疫組織化學指標與患者臨床病理指標之間的內在聯系。

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