人參皂苷Rb1經ERK1／2對H2O2誘導的乳鼠心肌細胞損傷的保護作用1）

楊 翠，任建勛，吳紅金，王玉祥

生理狀態下，心肌細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生與清除處于穩態平衡。氧化應激時，ROS在細胞內過量蓄積，產生細胞毒性，造成細胞功能障礙，最終導致其壞死和凋亡［1］。過度氧化應激導致心肌細胞凋亡明顯增加，在冠心病、心肌梗死、心力衰竭、心肌缺血再灌注損傷等心血管病理過程中扮演重要角色。抑制氧化應激誘導的心肌細胞壞死和凋亡是防治缺血缺氧性心臟病的有效策略，成為許多中藥活性成分心肌保護作用研究的切入點［2，3］。人參皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1，Gs－Rb1）是從人參中提取出來的主要活性成分，大量研究表明 Gs－Rb1能減輕心肌缺血再灌注損傷［4，5］，然而 Gs－Rb1抗氧化保護心肌細胞的確切的分子機制尚未完全闡明。本研究采用H2O2誘導乳鼠心肌細胞造成氧化性損傷，探索Gs－Rb1對氧化應激所致細胞損傷的直接保護作用，并對其相關機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 出生24h的SD大鼠乳鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2012－0001。

1.1.2 主要試劑 人參皂苷Rb1購自中國食品藥品檢定研究院；DMEM高糖培養基、胎牛血清購于Hyclone公司；胰蛋白酶購于Amresco公司；膠原酶Ⅱ購于Worthington Biochemical公司；MTT購于Sigma公司；TUNEL試劑盒購于Roche公司；Phospho－p44／p42ERK1／2Antibody購于 Cell Signaling Technology公司；H2O2購于北京宏盛苑化工有限公司；原花青素購自上?？稻呕び邢薰?。

1.1.3 主要儀器 CO2培養箱購自SANYO公司；505酶標儀購自BIO－RAD公司；熒光顯微鏡購自OLYMPUS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代心肌細胞培養 出生24h內的SD大鼠乳鼠，無菌操作下取心臟并修剪。磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，在50 mL的離心管中將其剪碎成1mm3～2mm3大小的組織碎塊。隨后用含0.25%胰蛋白酶和0.05%膠原酶Ⅱ的PBS輕柔吹打消化8min，靜置后1min后收集細胞懸液，放入含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養液中終止消化；以上過程反復進行，直至組織塊完全消化。細胞懸液經200目篩網過濾去除未消化的組織，在4℃時以1 000r／min離心8min，棄上清，并用10%胎牛血清的高糖DMEM培養液重懸。臺盼藍染色計數，調整細胞數至5×106／L。接種到25mL培養瓶中，置37℃培養箱（含95%空氣＋5%CO2）中培養1.5h以純化心肌細胞（差速貼壁法）。接種到12孔或96孔培養板中，每24h觀察細胞貼壁及生長情況，并更換培養液。待72h細胞融合出現搏動進行后續實驗。

1.2.2 原代心肌細胞H2O2損傷模型的建立及分組 上述原代培養的心肌細胞隨機分為6組?？瞻讓φ战M：37℃孵箱常規培養；模型組：加入終濃度為100μmol／L H2O2，37℃孵箱培養；陽性對照組：在加入終濃度為100μmol／L原花青素2h后，加入與模型組等量的 H2O2，37℃孵箱培養；Gs－Rb1低、中、高劑量組分別在加入50μmol／L、100μmol／L、200μmol／L Gs－Rb1 2h后，加入與模型組等量的H2O2，37℃孵箱培養。

1.2.3 MMT法檢測細胞活性 各組加入H2O2后18h采用MMT法檢測細胞活力。棄去細胞培養液，PBS沖洗后每孔加入 MTT 20μL（0.5mg／mL），置于CO2培養箱中繼續培養4h，吸出孔內培養液后，加入DMSO 150μL／孔，將培養板置于微孔板震蕩器上振蕩10min，充分溶解，酶標儀在490nm波長檢測各孔吸光度值（OD）。

1.2.4 心肌細胞凋亡的檢測 各組加入H2O2后18h，吸取培養基，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定。經0.2%Triton－X－100液通透處理，加rTdT酶、核苷混合物的混合液37℃避光孵育1 h后終止反應，PBS沖洗后在熒光顯微鏡下采用綠色熒光進行觀察和分析，對同一片取5個不同視野計數所有細胞和凋亡細胞，計算凋亡率。凋亡率＝凋亡細胞數／總細胞數×100%。

1.2.5 心肌細胞ERK1／2磷酸化水平檢測 各組加入H2O220min后，采用 Western blot進行ERK1／2蛋白磷酸化檢測。棄去培養基后預冷的PBS沖洗3次，加入預冷的細胞裂解液于冰上充分裂解，提取總蛋白并用BCA法檢測蛋白濃度。所有不同組蛋白樣本分別加入上樣緩沖液后煮沸5min變性，蛋白進行12%SDS－PAGE凝膠電泳分離后采用濕法轉膜轉移至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白室溫封閉1h，加入磷酸化特異性單克隆ERK1／2抗體孵育、4℃過夜、TBST洗滌3次（每次10 min）后加入二抗孵育，室溫孵育2h；TBST洗滌3次（每次10 min）后加入ECL處理、X線膠片曝光、顯影及定影。采用IPP 6.0進行灰度分析，以p－ERK1／2蛋白條帶灰度值與t－ERK1／2蛋白條帶灰度值比值反映ERK1／2磷酸化的程度。

1.3 統計學處理 數據以均數±標準差（x±s）表示，采用One－Way ANOVA（單因素方差分析）方法，方差齊性應用Student－Newman－Keuls檢驗，方差不齊采用Tamhane’sT2檢驗。P＜0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組心肌細胞活性的比較 與空白對照組比較，模型組心肌細胞活力明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，原花青素組以及Gs－Rb1低、中、高劑量組心肌細胞活力明顯提高，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。詳見表1。

2.2 各組心肌細胞凋亡率的比較 與空白對照組比較，模型組心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，原花青素組以及Gs－Rb1低、中、高劑量組心肌細胞凋亡率明顯下降，具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。詳見表1。

表1 各組乳鼠心肌細胞活力和凋亡率變化（x±s）

2.3 各組心肌細胞ERK1／2蛋白磷酸化水平的比較 與空白對照組比較，模型組心肌細胞p－ERK1／2表達明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，原花青素組以及Gs－Rb1高劑量組心肌細胞p－ERK1／2表達則顯著增加（P＜0.05）。詳見圖1、表2。

圖1 Gs－Rb1對乳鼠心肌細胞p－ERK1／2蛋白表達的影響

表2 各組乳鼠心肌細胞p－ERK1／2蛋白表達的變化（x±s）

3 討 論

細胞凋亡，又稱程序性細胞死亡，是一種嚴格受基因調控的細胞自主性死亡，參與著機體多種病理生理過程。氧化應激是心肌細胞發生凋亡的重要介導因素，心肌缺血、缺氧時，大量內源性ROS在心肌細胞內發生蓄積，通過特殊的信號通路誘導細胞發生凋亡［1，6］。本研究采用H2O2作為外源性ROS作用于心肌細胞，MTT法和TUNEL法檢測結果顯示，H2O2成功造成心肌細胞氧化損傷，誘導心肌細胞發生凋亡。

一些特定的信號通路參與氧化應激所致的心肌細胞損傷與凋亡，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）信號通路是其中重要的一條，而細胞外信號調節激酶（extracellular signal－regulated kinase，ERK）是 MAPK家族的重要組成部分，精細調控細胞的增殖、分化、存活及凋亡［7］。目前認為對于ERK磷酸化的調節是干預心肌細胞在缺血缺氧條件下凋亡的重要途徑。研究發現，中藥成分丹參素對缺氧所致的心肌細胞損傷具有保護作用，其機制可能與激活ERK1／2途徑而抑制心肌細胞凋亡相關［8］。α－硫辛酸能增加ERK1／2磷酸化水平對葡萄糖／葡萄糖氧化酶誘導的心肌細胞損傷有保護作用，而使用ERK1／2抑制劑后，該保護作用消失［9］。此外，瘦素可能通過活化ERK1／2通路抑制H2O2誘導的H9c2心肌細胞凋亡［10］。

現代藥理研究表明人參多種活性成分具有抗心肌細胞凋亡、清除氧自由基、改善心肌能量代謝和增加心肌收縮力等廣泛的心血管調節作用。前期研究發現［11，12］，人參皂苷Re和人參皂苷Rg1均能抑制60Co照射誘導的乳鼠心肌細胞凋亡，ERK、JNK和p38MAPK通路可能參與介導這種心肌細胞保護作用。Gs－Rb1作為人參的又一主要活性成分，研究顯示其具有顯著的抗心肌缺血再灌注損傷作用，可能與其上調eNOS表達，抑制自由基對心肌組織的氧化損傷有關［4］。同時，Gs－Rb1可能通過抗脂質過氧化與減輕細胞內鈣超載抑制H2O2誘導的乳鼠心肌細胞凋亡［13］。還有研究發現Gs－Rb1通過穩定線粒體膜電位而發揮抗心肌細胞凋亡作用［14］。另有實驗證明［15］，Gs－Rb1能清除ROS，抑制ROS誘導的JNK通路的激活，從而產生心肌細胞保護作用。然而，Gs－Rb1是否通過ERK1／2途徑而減輕氧化應激對心肌細胞的損傷還不得而知，本研究主要以ERK途徑為切入點，細胞、分子兩個層面來探討Gs－Rb1對H2O2誘導的心肌細胞損傷的保護作用。原花青素作為一種強抗氧化劑，具有較強的清除氧自由基作用，被我們選用作為陽性藥物對照組。本研究結果表明，原花青素及低、中、高劑量的Gs－Rb1均可抑制H2O2誘導的心肌細胞損傷和凋亡。進一步研究顯示，與空白對照組相比，H2O2誘導的氧化損傷組心肌細胞的p－ERK1／2表達下調，原花青素組和高劑量Gs－Rb1可通過誘導心肌細胞p－ERK1／2表達增加的途徑對抗H2O2引起的細胞氧化損傷和凋亡。

綜上所述，H2O2可誘導乳鼠心肌細胞損傷和凋亡，而Gs－Rb1能減輕這種細胞損傷而具有心肌細胞保護作用，其作用機制可能與激活ERK信號通路相關。然而，Gs－Rb1介導的這種心肌保護作用是否與其他信號通路相關，其確切的分子機制還有待進一步的研究證明。

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